Destruction a sejtek és fehérjék extrahálására
Ris.1.2.1. Ultrahangos homogenizátor (a), egy mágneses homogenizáló (b)
Megszerzése után tartalmazó extraktumot enzimet vizsgálat alatt, a terméket tisztítás. Minden módszer elválasztására alapuló keverékek, hogy a megosztott komponensek eredményeként bármely manipulációk különböző részein jelennek meg a rendszer, és lehet mechanikusan elválasztani egymástól. Izolálása egyes fehérjék egy lépésenkénti eljárással, például a az első tisztítási lépésben frakciók sokaságát tartalmazza szennyeződések. Minden elválasztási szakasz kell kapott frakciót gazdagabb szükséges anyagot, mint az előző. Egy ilyen eljárás gyakran nevezik frakcionált. Minden egyes elválasztási szakasz a fehérje oldatban vagy csapadék formájában.
Közvetlenül a tisztítást megelőzően az enzimek koncentrált fehérjét megoldásokat. Ez megvalósítható módszerekkel: a) kicsapás, majd oldódás egy kisebb térfogatú; b) ioncserés adszorpció, majd eluáljuk; c) ultraszűrés. Után vagy előtt a fehérjekoncentráció készítmények végezték a dialízis, ami a mintából egy féligáteresztő membrán eltávolítja a kis molekulatömegű vegyületek, amelyek szubsztituálva vannak pufferrel. Dialízis oldott molekulák kis molekulatömegű anyagok áthaladnak a féligáteresztő membránon, és nem képes dializáljuk kolloid részecskék, ott is marad (ábra. 1.2.2). A legegyszerűbb dializátor egy kollódiumban zsák (félig áteresztő anyag), ahol a folyadék dializálható. A tasak merítettük az oldószerben. Fokozatosan dializátum koncentrációja dializálható anyagok folyékony és oldószer egyenlő. Változtatásával az oldószerben, akkor lehet elérni gyakorlatilag teljes tisztítást a nemkívánt szennyezésektől. A dialízis sebesség rendkívül csekély. Ahhoz, hogy felgyorsítja a dialízis-membrán terület megnövekszik, a hőmérsékletet emeltük, és folyamatosan helyébe oldószert. Kivonat az utolsó dialízis, az úgynevezett dializáló oldatot.
Ábra. 1.2.2. A legegyszerűbb rendszer dialízis
A kezdeti szakaszban a tisztítás fehérjék elválasztása hőkezelés néha használják. Ez hatékony, ha a fehérje viszonylag stabil melegítési körülmények között, míg a kísérő denaturált fehérjék. Ily módon változhat a pH, kezelési idő és a hőmérséklet.
Miután az első fehérje tisztítási lépéseket extraktum eltérő oldhatósága, molekulatömeg, méret a teljes díjat a molekula, a relatív stabilitás, stb Ezek a különbségek használunk a további fehérjék elválasztására.
A klasszikus módszer protein elválasztás egy módszer alapuló szétválasztás különböző oldhatóságuk. Hogy kicsapjuk a, hogy csökkenteni kell semmilyen módon a fehérje oldhatóságát. Általában a fehérjék oldhatósága függ, hogy képesek hidratálást. A globuláris fehérjék, vízben oldódó, nagy szintű hidratációs biztosítja elrendezése hidrofil csoportok a felszínen. A szerves oldószerek hozzáadása csökkenti a hidratálási fokát, és vezet a fehérje kicsapódását. Az elv a módszer abban a tényben rejlik, hogy a koncentráció növekedésével a szerves oldószer csökkenti a képességét, víz szolvát a töltésű hidrofil enzim molekulákat. Csökkent fehérje oldhatóságát történik, hogy a szintet, amelynél az aggregáció és a csapadék kezd. Befolyásoló fontos paraméter a lerakódás, a méret a fehérjemolekula. A nagyobb fehérje-molekula, annál kisebb a koncentrációja a szerves oldószer hatására a fehérje kicsapódását.
Proteinek szintén kivált sók útján, például ammónium-szulfátot. Ezt a módszert nevezik sózás. Kisózás hozzáadásával a kívánt mennyiségű só - hatékony koncentráció módszerrel. Az elv a módszer azon a tényen alapul, hogy növeljük a sókoncentrációt az oldatot sűrített ionos speciesz képződik ellenionok protein, amely hozzájárul a konvergencia a kritikus távolság, amelynél intermolekuláris erők van der Waals vonzóerők meghaladják a taszító Coulomb erők ellenionok. Ez vezet adhéziós fehérje részecskék és kicsapódását.
A fehérjék izolálására is használják izoelektromos kicsapásos módszerrel. A felelős a fehérjék oka elsősorban asparatata és glutamát maradékok (negatív töltés) és a lizin és az arginin (pozitív töltésű). A növekvő pH-n a fehérjék különféle módokon díjat változik pozitív negatív értékek és az izoelektromos pont nullával egyenlő, ahol a fehérje elveszti ionos légkör és a részecskék összetapadnak, kicsapva.
A kicsapott fehérjét csapadékot szűréssel vagy centrifugálással. Részecskék kicsapódott anyagot a centrifugális erő lerakódnak az alján a centrifuga csésze és préseljük egy sűrű csapadék. Nagy sebességű centrifugával (ultracentrifuga) hozzon létre egy centrifugális gyorsulás körülbelül 100000g, így megostromolja nagy Szupramolekuláris aggregátumok - riboszómák és a vírusok.
Gélszűréssel módszer és gyorsan osztott fehérjéket méretük alapján. A hordozó egy kromatográfiás, amely egy térhálósított háromdimenziós molekuláris hálózat alakult granulátum formájában. Minél nagyobb a térhálósodás, annál kisebb a méret a lyukak. A gél működik, mint egy molekulaszita. Azáltal az oldat átengedése töltött oszlopon át Sephadex gyöngyöket, durva részecskék nagyobb, mint a pórus mérete Sephadex fog gyorsan. Kis molekulák lassan, mert fog hatolni a gyöngyöket (ábra. 1.2.3) a folyamat a mozgás.