Cryopreservation - stadopedia
Cryopreservation - fagyasztás ultra-alacsony hőmérsékleten. Általában folyékony nitrogénben, -196 ° C hőmérsékleten hajtjuk végre.
Az alacsony hőmérsékletű megőrzés sikere számos tényezőtől függ:
- a sejtek típusa és típusa,
- koncentrációjuk a szuszpenzióban,
- a konzervkörnyezet összetétele,
- a krioprotektáns típusát és koncentrációját,
- hűtés és fűtés üzemmód,
- a sejtek rehabilitációját a fűtést követően.
Jelentős szerepet a sikeres befagyasztása sejtek játszik azok morphophysiological állapot: sejtek a stacioner növekedési szakaszban, kevésbé ellenálló a károsító hatását az alacsony hőmérsékletű megőrzése, mint a sejtek az exponenciális növekedési fázisban. A fagyasztási sejteket a növekedési görbe exponenciális fázisának közepén vettük fel.
Ugyanilyen fontos a fagyasztott felfüggesztés sűrűsége. A sejtjavításra optimális eredményeket kaptunk egy sejtszuszpenzió fagyasztásával 1 × 10-5-510 sejt / ml sűrűséggel.
A növényi sejtek esetében gyakran előkezelésre van szükség különleges körülmények között. Különféle anyagokat adunk a táptalajhoz, például:
- 2-6% mannit vagy szorbit a vacuolák méretének csökkentésére;
- aminosavat, elsősorban prolint, amely a sejtben lévő víz kötését szolgálja (koncentráció 1 mólig vagy 11,5% -ig), aszparagin, # 947; -amino-vajsav;
- dimetil-szulfoxidot (DMSO) tartalmaz, amelyet 48 óráig 2,5-10% -os koncentrációban adunk a prekurzális tápközeghez a citoplazmatikus membrán permeabilitásának növelése céljából;
- Továbbá alkalmazni mesterséges keményedés a hideg, amikor az alsó tenyészet hőmérsékletét, szimuláló természetes csökkenése az előállítási eljárás a téli nyugalmi időszakban (csak azokra a mérsékelt éghajlaton a növények). Sejttenyészetek tartjuk néhány napig hőmérsékleten 8-10 ° C, majd a 2-5 ° C-on 1 - 6 hét.
Az állatokból származó növényi sejtek fagyasztásának folyamata főleg egy előtenyésztési lépés jelenlétével jellemezhető.
A krioprotektánsok olyan anyagok, amelyek csökkentik a fizikai-kémiai tényezők káros hatását a krioprezervációban. Ezek közé tartozik a szacharóz, dextrán, etilénglikol, polivinil-pirrolidon, dimetil-szulfoxid (DMSO), glicerin. A krioprotektáns toxicitásának meghatározásához a sejteket különböző koncentrációkban 30-50 percig szobahőmérsékleten tartják, majd életképességüket meghatározzák. Ezenkívül védő tulajdonságait a tenyészetek próbafagyasztásával és felolvasztásával értékeljük. A leggyakrabban alkalmazott krioprotektánsok a glicerin és a DMSO. A krioprotektáns hozzáadása előtt a sejtszuszpenziót centrifugálással koncentráljuk, a felülúszót leöblítjük. A krioprotektort a fagyasztás előtt egy órával vezetik be a tenyészetbe, ami a membrán permeabilitásának megváltozásához, a fagyáspont megváltozásához és a felolvasztáshoz vezet.
A hűtési programok eltérőek lehetnek, de mindegyiket lassú hűtési sebesség jellemzi. Fagyás közben a sejtek belsejében és azon kívül jég alakul ki. Ezeknek a változásoknak a jellege a vizsgált mintától és a fagyásgátló kezeléstől függ, főleg a hűtési sebességtől függ. Lassú hűtés esetén az extracelluláris jég keletkezik, ami a sejtek dehidratálódásához vezet, mielőtt elérné a citoplazma fagyáspontját. Gyors hűtéssel a sejtek gyorsan befagynak belülről, lassabban dehidrálódnak, ami a sejten belüli jégkristályok képződéséhez vezet. Ebben az esetben a sejtek sérültek. A hűtést általában két lépésben végzik el (26. ábra):
Ábra. 26. A sejtfagyasztás: a) gyors, b) lassú, lépésenként
Stage 1: +20 és -28 ° C sebességgel 1 fok per perc (0,5 fok fagyasztás növényi sejtek percenkénti -35 ° C), ezen a hőmérsékleten tartjuk 15 percig.
A második szakasz: folyékony nitrogénbe merítés (pillanatnyi hűtés -196 ° C).
A fagyasztás speciális berendezéssel történik. Ezek hiányában - alkohol fürdőben (0,5 - 1 liter alkoholt öntünk a fém termosz lombikot elmerül benne 15 percig ampullák és hozzáadjuk, keverés közben folyékony nitrogén vagy szárazjég, a hőmérsékletet -32 ° C (a hőmérséklet kell lennie legfeljebb -28 és nem lehet alacsonyabb -32 ° C-nál). A további ampullákat folyékony nitrogénre visszük át.
Amikor a felolvasztás ampullák csipesszel át vízfürdőn 37-40 ° C-on, az ampullát térfogata 1 ml felolvasztott számára 0,5-1 perces.
Felolvasztás után a sejteket vagy tápközegben (állatok) vagy hordozóközegben mossák. A vegetatív sejteket szintén 3-10% szacharózoldattal lehet mosni.
Ezután a sejteket életképes festékekkel ellenőrizzük, élethű festékek segítségével. Az utolsó kritérium a növekedés világos újraindulása az adott kultúrában alkalmazott tápanyag-tápközegek esetében.
Az állati sejtek felengedését követő átültetett tenyészetének fokozott érzékenysége van a vírusokkal szemben, ami az első két szakaszban manifesztálódik. Ezután az érzékenység visszatér az eredetihez.