Kvalitatív és kvantitatív meghatározására szolgáló módszerek a IgA, IgG és IgM
Az immunglobulinok - a glikoproteinek által kiválasztott plazma sejteket. Az antitest jelentkezik után általában az antigén stimulációt. A legtöbb antigének indukál egyidejű stimulálása több klónt a B-limfociták - poliklonális stimuláció. Antitestek által termelt egyik klón B-limfociták, - monoklonális antitestek - azonosak. Antitestek között, amelyek által termelt különböző klónok B-limfociták, mindig van különbség, például a szerkezet az antigénkötő hely vagy antigénkötő erő. Öt osztálya van immunglobulinok: IgA, IgD, IgE, IgG, IgM. Az alapja szerkezete az immunglobulin-molekula bármilyen osztályba jelentése Y-alakú szerkezet, amely két nehéz és két könnyű láncot kapcsolódik diszulfid hidakkal (lásd. Ch. 1, p. IV.A.4). „Ágai” a molekula (Fab-fragmens) használják antigénkötő, és a „törzs» (Fc-fragmens) végre más biológiai funkciók: aktiválják a komplementet, kötődnek a sejtmembránhoz, és IgG, stb vannak jelen biológiai folyadékokban formájában monomerek ... Azt, hogy egy nagy részét a szérum immunglobulinok, és a fő osztálya immunglobulin termelt másodlagos immunválaszt. IgE, továbbá monomer játszanak az allergiás reakciókban az azonnali típusú. IgD találhatók elsősorban a membránok a B-limfociták, és szolgálnak antigént-receptor a szérumban jelen lévő kis mennyiségben formájában monomerek. IgA tartalmazott szérumot túlnyomórészt formájában monomerek, váladékot és kolosztrum - például dimerek tartalmazó, mint a J-láncot és egy szekréciós komponens, amely szintetizálódik a nyálkahártya epitélium. A dimer IgA kötődik a szekréciós komponens áthaladó felszíni epitélium a nyálkahártya. IgM van jelen a szérumban túlnyomórészt formájában pentamerekkel. Ezek teszik ki a nagy részét a termelődött immunglobulin az elsődleges immunválasz. Módszerek az immunglobulinok közé tartoznak szintjének meghatározására immunglobulinok különböző osztályainak és alosztályainak antitestek és bizonyos antigének. Annak értékelésekor a tanulmány eredményeit figyelembe kell venni, hogy a szint immunglobulinok függ az életkortól (lásd. IV és V). Változások a szintje immunglobulinok szérum következménye lehet egy megsértése ezek szintézise katabolizmust vagy kiválasztását.
2. immun. A módszer a következő: 1) végezzük elektroforetikus elválasztását fehérjék a gél; 2) végén elektroforézis után a gélt párhuzamosan vágva az irányt elektroforézis horony; 3) Egy horony van készített antitestek (antiszérum), például egy nehéz (alfa, delta, epszilon, gamma, mu) vagy könnyű (lambda, kappa) láncok az immunglobulinok. Az antitesteket és a fehérjéket elektroforézissel elkülönítjük diffúz egymás felé. Azokon a helyeken, ahol az antitestek kötődnek a fehérjékhez, precipitin ív kialakulását (lásd. Ábra. 20.2). Immunelektroforézis csak lehetővé teszi, hogy értékelje a minőségi összetételét a vizsgálat proteinek keveréke. Az értékelés eredményeit a kutatás igényel nagy szakértelmet. Leggyakrabban, ezt a módszert alkalmazzák a detektálása és jellemzése monoklonális antitestek.
3. elektroforézis immunfixációs. Ez a módszer támaszkodik elektroforetikus elválasztását szérumfehérjék a gélben, majd inkubáltuk a gél jelenlétében antitest nehéz és könnyű láncai immunglobulinok. immunkomplexek, ami látható festést követően (lásd. ábra. 20.3) vannak kialakítva a fehérjék kötődését az ellenanyagokhoz. Az immunkomplexeket tartalmazó normál immunglobulinok letétbe, mint egy széles, diffúz sávot, monoklonális - egy szűkebb és világosan meghatározott. Ez a módszer is minőségi, de sokkal érzékenyebb és egyszerű, mint immun. Immunfixációs elektroforézist gyakran kombinálva alkalmazzák immunelektroforézis meghatározásához monoklonális vagy oligoklonális immunglobulin.
B. A kettős radiális immundiffúziós - szemikvantitatív módszert, amelynek nemcsak az lehetséges, hogy azonosítani az antigéneket, hanem, hogy értékelje a hasonlóság mértéke közöttük. A módszer a következő: 1) a lyukakba vágva az agar, az elegyet bevezetett vizsgáltuk antigének és antitestek ismert specifitású (általában központi furat teszi antitestek, és a körül vannak elhelyezve, hogy - antigének); 2) antigének és az antitest diffúz egymás felé; 3) azon a ponton, ahol volt egy kötő antitestek és antigének precipitációs csíkot. A kölcsönös elrendezése és alakja a precipitációs csíkok tudja becsülni a hasonlóság mértéke közötti antigének, amelyek a szomszédos kutak. Jelenleg ezt a módszert alkalmazzák a diagnózis az autoimmun betegségek elleni autoellenanyagok kimutatására, hogy extrahálható nukleáris antigén (lásd. Ch. 15, p. II.D.2). Bár a a módszer érzékenysége kettős radiális immundiffúzióval rosszabb, mint a sok kvantitatív módszerek, technikailag egyszerű, és nem igényel nagymértékben tisztított ellenanyagok, specifikus és alatt is használható tömeges kísérletek.
G. nephelometriával - meghatározzuk a szuszpendált szilárd anyagok koncentrációja és a magas molekulatömegű anyagok oldatban, értékelése alapján a fényszórás-intenzitás áthaladó oldatot. Ria fel lehet használni, hogy meghatározzuk a koncentrációját antigének, mint hozzáadásával hozzá antitest immun komplexek képződnek, diffundáló az áteső fény. Ria nagy pontossággal, hogy meghatározzuk a koncentrációját IgG, IgA, IgM, alosztályok IgG, C3, C4, B-faktor, a C-reaktív protein és az egyéb savófehérje. Ez a módszer alkalmas a meghatározására fehérje alacsony koncentrációban, például IgE, a szérum, amely nem haladja meg az 1 mg / ml. Jelenleg sok laboratóriumok nephelometriával standard módszer mennyiségi meghatározására immunglobulinok.
E. ELISA. Amint egy szilárd fázisú leggyakrabban használt polisztirol lemezeken adszorbeált velük antigének vagy ellenanyagok. Meghatározása antitestek bármilyen antigén a következők szerint végeztük: 1) a vizsgálati folyadékot bevezetjük a lyukakat adszorbeált antigénnel rájuk; 2) az inkubálás során antitest kötődik az antigénnel; 3) A lemezt mossuk, szabadon nem kötött antitestet, és a hozzáadott antitestek immunglobulinok (szekunder antitest) egy enzimmel jelzett; 4) A lemezt újból mostuk, és enzim-szubsztrát kromogén (olyan anyag, amely megváltoztatja a színét során kémiai reakció); 5) az intézkedés alapján az enzim reakciótermék kromogén színt vált. Minél több enzimmel jelzett második antitest kötődik az antigén-antitest komplexek, a magasabb az enzim aktivitása és a szín intenzitása az oldat (lásd. Ábra. 20,5). A Megmértük az antitestek koncentrációját meghatározzuk a mintában spektrofotometriásán - optikai sűrűsége a színes oldat. Ugyanezt a megközelítést alkalmazzuk, hogy meghatározzuk az antigén a mintában. Ebben az esetben a lemezt használunk antitestek adszorbeálva a tesztantigénhez, enzimmel jelzett második antitest továbbá az ezen antigén (lásd. Ábra. 20,5). ELISA-t használunk, hogy mennyiségileg az antitestek és antigének. Érzékenység hasonlítható a RIA, de ez sokkal egyszerűbb, olcsó és nem igényel a használata radioaktív izotópokat. Sok centrum alkalmazza egy szilárd fázisú ELISA-val szabványos módszert meghatározzuk az antivirális antitestek, beleértve az antitesteket, hogy a HIV, citokinek, és immunglobulinok (IgE és IgG alosztályok).
J. blot - kvalitatív módszerrel azonosítani antigének és antitestek a vizsgált mintában. Antitestek ezzel a módszerrel detektáltuk a következők: 1) keveréke ismert antigének elektroforézissel elválasztjuk egy poliakrilamid gélen, és átvittük nitrocellulóz membránra; 2) a membránt inkubálunk a vizsgált minta, például szérum, majd - a jelölt antitestek immunglobulinok. Azonosításához antigének elektroforetikus elválasztás kitéve vizsgálati minta fehérjéket azután átvisszük egy membránra, majd hozzáadunk jelölt antitestek az ismert antigének. A jelenleg rendelkezésre álló kész szettek immunoblottinghoz. Ezt a módszert széles körben használják, hogy erősítse meg ELISA eredményeket a diagnózis a HIV-fertőzés.
Z. További kutatási módszerek
1. Indirekt immunfluoreszcencia - módszer, amellyel a antitestek kimutatására ismert antigének. Az általánosan használt szöveti szekciókban vagy a kultúra sejtek antigénként forrás. A hordozót átjuttatjuk üveglemezre, jelenlétében inkubáljuk egy vizsgálati minta, például szérum, majd - jelenlétében egy fluorokróm jelölt antitestek immunglobulinok. A megkötött antitesteket egy szubsztrát egy fluoreszcens mikroszkóppal. Ez a módszer általában kimutatására használt antinukleáris antitestek és antitestek egyes vírusok. Bár a módszer nem a mennyiségi, ez elég érzékeny és egyszerű.
2. alapuló módszerek agglutináció. A agglutinációs reakció általában használt eritrociták (hemagglutinációs) és latex részecskék (latex agglutináció) bevonva egy ismert antigént. A antitestek jelenléte az ezen antigén agglutinációs vörösvértestek vagy a latex-részecskék. Hemagglutinációt használt antitestek detektálására tiroglobulin és mikroszomális antigének latex agglutináció - kimutatására reumatoid faktor és más antitesteket. Ezek a módszerek lehetővé teszik az egyszerű és mennyiségi meghatározására egy antigén, de kevésbé érzékeny, mint a RIA és ELISA.