A DNS elosztása
- A sejtek és sejtmembránok lízise.
A sejteket mechanikusan vagy enzimatikus kezeléssel elpusztítják. A membránokat detergensekkel (pl. SDS) vagy kaotrop szerekkel (guanidin-izotiocianát) való kezeléssel elpusztítják.
A fehérjéket fenol, kloroform, izoamil-alkohol keverékével extraháljuk. Mivel ezek a szerves rastvoritley sűrűsége eltér a víz sűrűsége centrifugálással sejtlizátumot, amelyhez adunk fenollal és kloroformmal, alkotó két különálló rétegből áll: az alacsonyabb, ami a megoldás szerves oldószer alapú, és a felső tartalmazó vizes oldat. A fehérjék denaturálják és csapadékot képeznek, amely a vizes és a szerves fázis határán keskeny sávot képez. Ha a fenolt semleges pH-pufferrel egyensúlyozták, a vizes fázis mind DNS-t, mind RNS-t tartalmazna.
Ha a fenol-volna pufferrel egyensúlyoztunk savas pH-jú, a DNS-t lesz az alsó, szerves fázist, és RNS - a felső, vizes.
Használt DNS kicsapás etanollal (izoprapanolom) jelenlétében só (nátrium-acetát), ezt követi a csapadék elválasztása centrifugálással, és feloldjuk a csapadékot a DNS vagy adszorpció szilárd hordozóhoz (például, üveg) ezt követő elúciós.
A plazmid DNS izolálása
A lúgos módszer a plazmid DNS izolálására szolgál a sejtekből. A kísérlet során a genomiális és plazmid DNS-t tartalmazó oldat pH-ját lúgossá változtatjuk. Ebben a pH-ban az egész DNS-t denaturáljuk. Azonban, a lánc kétszálú plazmid-DNS-t így továbbra is társított egymással, mivel a plazmidnak van egy gyűrű alakú. A további lágyítás, amely kezdeményezett pH értékének változása az eredeti megoldás, hosszú láncú genomiális DNS, amelynek eloszlassa oldatban denaturáló nem strukturált formában sűrű köteg, és a plazmid DNS-láncot sikeresen visszaállítani az eredeti szerkezetet. Most a plazmid DNS könnyen elválasztható a genomi DNS-ből a centrifugálás során.
