Személyi oldal - a kicsapási reakció fehérjéinek kémiája
Az oldatban és ennek megfelelően a testben lévő fehérjék a természetes stabilitási tényezők miatt a natív (természetes) állapotban maradnak, amely magában foglalja a fehérjemolekula töltését és a körülötte lévő hidratált (víz) héjat. E tényezők eltávolítása a molekulák ragasztásához és kicsapódásához vezet. A fehérjék kicsapódása visszavezethető és visszafordíthatatlan lehet, a reagensek összetételétől és a reakciókörülményektől függően. A klinikai laboratóriumi gyakorlatban lecsapási reakciót használjuk, hogy elválasszuk az albumin és globulin frakciókat (csoport) a vérplazma fehérjék, számszerűsítése azok jellemzői a stabilitás a plazmában, a fehérje kimutatása biológiai folyadékokban, és engedje el őket annak érdekében, hogy a képződő fehérje-mentes megoldás.
A csapadékfaktorok hatására a fehérjék kicsapódnak, de ezeknek a tényezőknek a megszüntetése (eltávolítása) után a fehérjék újból oldódnak és megszerezik eredeti tulajdonságaikat. A fehérjék reverzibilis kicsapódásának egyik típusa sóderlés.
Alapelv: Az ammónium-szulfát telített oldatával a fehérjék albuminfrakciója kicsapódik, az ammónium-szulfát félig telített oldata a globulin frakció.
A reakció lényege a fehérjemolekulák dehidrációja (dehidratálása).
Reagensek: 1) hígítatlan tojásfehérje; 2) ammónium-szulfát telített oldatát; 3) nátrium-hidroxid, 10% -os oldat; 4) réz-szulfát, 1% -os oldat; 5) por ammónium-szulfát; 6) desztillált víz.
A meghatározás folyamata: 30 csepp hígítatlan tojásfehérjét öntjük a csőbe, és egyenlő mennyiségű telített ammónium-szulfát-oldatot adunk hozzá. A cső tartalmát összekeverjük. Félig telített ammónium-szulfát oldatot kapunk, míg a fehérje globulinfrakciója kicsapódik, és az albumin frakció oldatban marad. 5 perc elteltével a csapadékot leszűrjük, a globulin frakció a szűrőn marad és az albumin frakció a szűrletben. A szűrletből származó csapadékot üvegrúddal eltávolítjuk és egy csőbe visszük át, ahol több csepp vizet adunk hozzá, amíg a csapadék fel nem oldódik. A fehérje jelenléte az oldatban biuret reakcióval igazolható, ami pozitív lesz.
A csőbe ammónium-szulfát port adunk a szűrlethez, amíg az oldat teljesen telített, azaz amíg a só fel nem oldódik. Ebben az esetben kicsapódik - albuminok. Szűrjük, a szűrőből származó csapadékot üvegrúddal eltávolítjuk, vízzel feloldjuk és biuret reakciót végzünk.
A fehérjék visszafordíthatatlan lecsapódása a fehérjék (szekunder és tercier) szerkezetében bekövetkező mély zavarokkal és az eredeti tulajdonságaik elvesztésével jár együtt. dást. A fehérjékben bekövetkező változások forrása, ásványi és szerves savak koncentrált oldatainak, nehézfémek sóinak stb. Hatása lehet.
2. reakcióvázlat "Csapadék at forrásban"
Alapelv: a fehérjék termálható vegyületek, és 50-60 ° C feletti melegítés esetén denaturálják. A termikus denaturáció lényege a hidrát héjának megsemmisítése, a kötések stabilizálását és a fehérjemolekula kibontakozását megakadályozó fehérje molekula megtörése. A legteljesebb és leggyorsabb csapadék az izoelektromos ponton fordul elő (amikor a molekula feltöltése nulla), mivel a fehérje részecskék a legkevésbé stabilak. A savas tulajdonságokkal rendelkező fehérjéket gyengén savas közegben kicsapjuk, és az alapvető tulajdonságokkal rendelkező fehérjék kissé lúgosak. Erősen savas vagy erősen lúgos oldatokban a felmelegített denaturált fehérje nem csapódik ki a csapadékba. a részecskék feltöltődnek, és az első esetben pozitív, míg a másodikban negatív töltetet hordoznak, ami növeli az oldat stabilitását.
Reagensek: 1) tojásfehérje, 1% -os oldat; 2) ecetsav, 1% és 10% -os oldatok; 3) nátrium-hidroxid, 10% -os oldat.
A meghatározás folyamata: 10 számozott csőben 10 csepp tojásfehérjét adunk hozzá. Ezután az első csövet forraljuk fel, míg a fehérjeoldat felhős lesz, de mivel a denaturált fehérje részecskéi töltést hordoznak, nem csapódnak le. Ez annak köszönhető, hogy a tojásfehérje savas tulajdonságokkal rendelkezik (az izoelektromos pont pH-ja 4,8), és negatív töltet van semleges közegben. A 2. csőben adjunk hozzá 1 csepp 1% -os ecetsavoldatot, és forraljuk fel. A fehérje kicsapódik, mivel oldala megközelíti az izoelektromos pontot, és a fehérje elveszíti töltését (az oldat egyik fehérje stabilitási faktora). Adjunk hozzá 1 csepp 10% -os ecetsavat a 3. csőhöz, és forraljuk fel. Nem képződik kicsapódás, mivel erősen savas közegben a fehérje részecskék pozitív töltést kapnak (az oldat egyik fehérje stabilitási faktora megmarad). Adjunk hozzá 1 csepp nátrium-hidroxid-oldatot a 4. csőhöz, és forraljuk fel. Az üledék nem képződik, mert a lúgos környezetben nő a fehérje részecskék negatív töltése.
3. reakció: "A nehézfémek sójának kicsapása"
Alapelv: a fehérjék kölcsönhatásba lépnek az ólom, a réz, a higany, az ezüst és más nehézfémek sói, és denaturálják és kicsapják. Azonban bizonyos sók feleslegével az eredetileg képződött csapadék feloldódása figyelhető meg. Ennek oka a fémionok felhalmozódása a denaturált fehérje felszínén és pozitív töltés megjelenése a fehérjemolekulán.
Reagensek: 1) tojásfehérje, 1% -os oldat; 2) réz-szulfát, 10% -os oldat; 3) ólom-acetát, 5% -os oldat, 4) ezüst-nitrát, 5% -os oldat.
A meghatározás folyamata: 3 számozott kémcsőben 5 csepp tojásfehérjét adunk hozzá. 1 csepp réz-szulfátot adunk az 1. csőhöz. A 2. csőben adjunk hozzá 1 csepp ólom-acetátot. A 3. csőben adjunk hozzá 1 csepp ezüst-nitrátot. A csapadékot minden kémcsőben leválasztjuk. Ezután 10 csepp réz-szulfátot adunk az első csőhöz, és 10 csepp ólom-acetátot adunk a második csőhöz, és a csapadék feloldódik. A harmadik tesztcsőben 10 csepp ezüst-nitrátot vezetnek be - nincs csapadék feloldódása.
4. reakció: "Csapadék koncentrált ásványi savakkal"
Alapelv: a koncentrált savak (kénsav, sósav, salétrom stb.) Fehérje denaturálódást okoznak a fehérje stabilitási tényezőinek oldatban (töltés és hidrat héj) való eltávolítása miatt. A sósav- és kénsav feleslegével azonban a denaturált fehérje kicsapódott csapadékja újra feloldódik. Nyilvánvalóan ez a proteinmolekulák töltéscseréjének és a részleges hidrolízisnek köszönhető. Felesleges salétromsav hozzáadásakor a csapadék feloldódása (a jelenség pontos mechanizmusa nem állapítható meg). Ezért használják a salétromsavat a kis mennyiségű fehérje meghatározására a vizeletben a klinikai laboratóriumokban.
Reagensek: 1) tojásfehérje, 1% -os oldat; 2) tömény kénsav; 3) tömény sósav; 4) tömény salétromsav.
A meghatározás folyamata: 3 számozott kémcsőben 10 csepp koncentrált savat öntünk: 1 kénsavat a kémcsőbe, 2 sósav csövet a kémcsőbe, és nitrogént a 3 csőbe. Ezután a csövet 45 ° C-os szögben billentse be óvatosan a cső falához (így a folyadék ne keverje össze) 1 csepp tojásfehérje-oldatot. Fehér gyűrűt képez a fehérréteg csapadéka a két réteg határán. Óvatosan rázzuk fel a csöveket, és felesleges savakat adunk hozzá, majd megfigyeljük a fehérje feloldódását a kémcsövekben kénsavval és sósavval, és a fehérje nem oldódik salétromsavval.
Reakció № 5 "Csapadék szerves savakkal"
Alapelv: a triklór-ecetsav csak a fehérjéket kicsapja, és a szulfoszalicilsav nemcsak a fehérjéket, hanem a nagy molekulájú polipeptideket is kicsapja. A szul-foszalicilsav (mint a legérzékenyebb) széles körben alkalmazható a fehérje kimutatására a vizeletben.
Reagensek: 1) tojásfehérje, 1% -os oldat; 2) triklór-ecetsav, 10% -os oldat; 3) szulfoszalicilsav, 20% -os oldat.
A meghatározás folyamata: 2 számozott csőben 5 csepp tojásfehérjét adunk hozzá. Ezután 2 csepp szulfoszalicilsavat adunk az 1. csőbe, és 2 csepp triklórecetsavat adunk a 2. csőhöz. A tesztcsövekben kicsapódott fehérje.