Eljárás egy kollagenáz inhibitor hepatopancreasból kereskedelmi állatfajok Rákcsapda szabadalmak
A találmány tárgya a biotechnológia, kifejezetten a termelés a kollagenáz inhibitorok, és felhasználhatók az állatgyógyászatban, élelmiszeriparban, valamint kutatási célokra. Az eljárás előírja, hogy a homogenizáció kereskedelmi fajok tarisznyarák hepatopancreas 0,1 M ammónium-acetát tartalmazó 0,1-1 mM kalcium-acetátot pH = 6,4-7,0. A homogenizátumot. A kapott felülúszót hozzáadtunk ammónium-szulfátot 60-70% telítettség és centrifugáltuk erőt. A kapott enzim komplexet feloldunk desztillált vízben hozzáadásával 0,1-1 mM kalcium-acetát, így egy valódi oldatot a tisztítás és a koncentrációt. Enzimek Polyfiber sómentesítjük membránon pórusméretű 100 kDa. A felülúszót, amely a kollagenáz inhibitor, desztillált vízzel mossuk. Fűtött, hogy 60-100 ° C-on, és a kapott csapadékot centrifugálással elkülönítjük. Az oldatot fagyasztva szárítjuk enzimek. 2 ZP f ly-1-il-csoport. 1. táblázat.
A találmány tárgya a biotechnológia, különösen a készítmény nagy tisztaságú és nagymértékben aktív készítmények az enzim-inhibitorok, amelyek alkalmazhatók a gyógyászatban, kozmetikai, állatgyógyászatban és élelmiszeripar, valamint kutatási célokra.
A kollagenáz királyrák sikeresen használják a gyógyászatban az égési sérülések kezelése, gennyes és trofikus fekélyek, műtét utáni hegek. Mechanizmus a gyógyulási folyamatot, ha a hatóanyag proteolitikus / kollagenolitikus fellépés lényege, lizáló nekrotikus szövet, ami a tisztítási sebek. A következő lépés a sebgyógyulás folyamatát, a hasznosítás új sejtek és szövetek, a bőr. Ha a koncentráció a kollagenázok és a kollagenolitikus enzimek előállítására igen nagy, a helyreállítási folyamat lelassítható hidrolízissel kollagén ezen enzimek által egészséges szövet, ezért szükséges, hogy blokkolja enzimatikus működése. Ez különösen fontos a szembetegségek kezelésére szolgáló. A legtöbb élettani módja - használata megfelelő inhibitorok, azonban, kollagenázok és kollagenolitikus enzimek rezisztens az ismert tripszin és kimotripszin. A kollagenáz oka kollagén lebomlását, amely kapcsolatban van a bőr idő előtti öregedését. Ezért kollagenáz inhibitor lehet építeni különböző kozmetikai termékek (krémek, lotionok, gélek, kenőcsök) kialakulásának megelőzésére ráncok vagy kezelésére bőratrófia.
Eljárás proteináz-inhibitor (de nem kollagenázok) a szervek szarvasmarha, amely abban áll, hogy a nyers anyagot őrölt, extrakciót végzünk savas közegben, kezeljük a kivonatot eltávolítása után kicsapjuk a cím szerinti terméket izoláljuk kromatográfiásan adszorbens szilikát típusú és kicsapjuk az eluátumból szerves oldószerek. Az említett eljárás szerint, a terméket izolálhatjuk, hogy a tevékenység a 500-1500 KIU / mg, azonban a termék nem felel meg az előírt követelményeknek a gyógyszerek proteináz inhibitor.
Német szabadalmi №1492114, A 61 K 17/00, 1972.
Eljárás kollagenáz inhibitor cápaporc. Cápaporc-extraktumok anti-angiogén, közvetlen protivoopuholevoproliferiruyuschey, gyulladásgátló és antikollagenoliticheskoy tevékenységeket. Az eljárás magában foglalja a következő lépéseket megszerzése homogenizátumot porc vizes oldatban, A homogenizátumot és ezt a további frakcionáljuk, hogy megkapja a teljes extraktumot tartalmazó molekulák legfeljebb 500 kDa. További frakcionálás a kivonat ultraszűréssel membránszűrők és gélszűréssel S-12, Superose és hidrofób kromatográfia SDS-S-hexil be FPLC üzemmódba (nagynyomású folyadék-kromatográfia) engedélyezve, hogy biztosítsa az egyik extraktumot frakciók (10 kDa) rendelkező antikollagenoliticheskoy aktivitással. Kifejtett gátló hatás kollagenáz 1-es típusú (MMT1) határoztuk meg fluorogén szubsztrát és elektroforézissel SDS-PAGE.
A folyamat nagyon bonyolult megvalósítani, mert a frakcionálási lépést tartalmaz több fogyasztó bonyolult műveletek megvalósítható csak jól felszerelt laboratóriumokban. Ezen túlmenően, a forrás az inhibitor - cápaporc lényegében mentes a proteolitikus enzimek, és az inhibitor által termelt fenti eljárás, amely vonatkozik a metalloproteinázok.
A legközelebbi műszaki megoldás egy eljárást az alapvető proteináz-inhibitor (de nem kollagenázok) a szervek szarvasmarha, amely, hogy a testek a szarvasmarha, amely inhibitorként (tüdő, hasnyálmirigy, nyálmirigy, őrölt (homogenizált), extrakcióval végezzük savas körülmények között, elválasztjuk torta, lipideket és fehérjéket eltávolítjuk, centrifugáljuk, bázikus extraktumot-proteináz-inhibitor-on kromatografáljuk sulphocationite, az eluátumot sósavval kezeljük pH = 1-3, a csapadékot szűréssel eltávolítjuk előtét fehérjék , A kapott felülúszót kezeltük triklór-ecetsavval, hogy annak koncentrációja 2,5-7,0%, ismét eltávolítjuk a szennyező fehérjék a felülúszóban sózott elsődleges proteináz inhibitor, amelyet azután kromatográfiásan tisztítjuk Sephadex, majd a gyógyszer izoláljuk acetonnal végzett kicsapás útján vagy fagyasztva szárítással. A pirogénmentes gyógyszer, amelynek aktivitása nem kevesebb, mint 5000 KIE / mg.
A hátrányok a folyamat egy többlépéses eljárás, a használata nagy mennyiségű éghető drága szerves oldószerek (alkohol, aceton) és a magas triklórecetsav koncentrációban (50%) sósav és nátrium-hidroxid, amely előírja, speciális körülmények között is hátrányosan befolyásolja a környezeti feltételek, igénylő a fejlesztés konkrét módszerek hulladék. Jelentős hátránya a lépésben használható sómentesítő oszlop egy költséges gyógyszer Sephadex importált. Lényegében ez a többlépcsős laboratóriumi módszer az inhibitor nem lehet méretezhető.
A célunk a találmánnyal az, hogy olyan eljárást elválasztására egy korábban ismeretlen inhibitor endogén kollagenolitikus enzimek hepatopankreászból király rák gazdaságos módon.
A probléma megoldódik annyiban, hogy az eljárás egy kollagenáz inhibitor, amely homogenizáló tartalmazó nyersanyag proteolitikus enzimek, az eljárást az jellemzi, hogy elvégezzük az homogenizáció nyersanyag 0,1 M ammónium-acetát tartalmazó 0,1-1 mM kalcium-acetátot pH = 6,4-7, 0, akkor a homogenizátumot centrifugáljuk, hogy a felülúszót hozzáadtunk ammónium-szulfátot 60-70% telítettség, a kapott enzim komplexet centrifugálással elkülönítjük, az utóbbit feloldjuk desztillált vízben hozzáadásával 0,1-1 mM kalcium-acetát, így a valódi szakító ORA, majd tisztítás, koncentrálás és a sómentesítés Polyfiber enzimek a membránon pórusméretű 100 kD és mossa tartalmazó felülúszót kollagenáz inhibitor desztillált vizet, majd melegítéssel 60-100 ° C-on, a csapadékot elválasztva centrifugálással és fagyasztva szárítás.
Jellemzően, a felülúszót desztillált vízzel mossuk, nem kevesebb, mint 3-szor, és a fűtés a felülúszó előnyösen 80-85 ° C-on 25-40 percig.
Hepatopancreasból rákok, különösen a király rák, egyik forrása a proteolitikus enzimek, beleértve a kollagenáz, képesek komplexet képezni endogén inhibitora, kollagenolitikus enzimek hepatopancreasból a rák egy speciális enzimek családja - brahiurinam. Ez szerin proteázok tulajdonságait egyesítik tripszin és kimotripszin, ezért a metalloproteinázok hatnak rájuk. Hepatopancreast elérhető, olcsó és nem toxikus nyersanyagként enzimkészítmények azonban kiválasztása korábban ismeretlen endogén kollagenolitikus enzim inhibitor hepatopankreászból király rák a fő célunk a jelen találmány.
Állítható elő a módszer inhibitor egy por világos-barna színű, könnyen oldódik a vizes pufferoldatok.
Abban a vizsgálatban, a gátló hatás a készítmény alkalmazásával előállított kromogén szubsztrát kollagenolitikus szerin proteináz PC Glp-Ala-Ala-Leu-pNA Kimutatták, hogy a gátló hatás dózisfüggő. Az eredményeket a táblázatban.
A kollagenáz aktivitás gátlás „Morikraza” készítmény igazoltuk elektroforézissel típusú kollagén I. hidrolizátum
Az ábrán az elektroforetikus jellemző az inhibitor és annak kollagenolitikus aktivitást gátló hatása A készítmény „Morikraza”. 12% PAGE, inkubálást végeztünk szobahőmérsékleten. 1. sáv - készítmény „Morikraza”, 2. sáv - inhibitor előállítására, 3-as sáv - előkészítésének I. típusú kollagén, 4. sáv - kollagén előállítására + hatóanyag „Morikraza” arányban 30: 1, inkubációs idő 1 óra + hatóanyag inhibitor inkubáció nélküli neki; 5-8 sávok: az inkubációs inhibitorral 2 óra, az arány az enzim: inhibitor = 1: 100 - 5. sáv (az inkubációs idő a kollagén „Morikrazoy” 1 óra), és 6. sáv (inkubációs idő kollagén „Morikrazoy” 24 óra); arány enzim: inhibitor = 1:50 - 7-es sáv (az inkubációs idő a kollagén „Morikrazoy” 1 óra) és 8. sáv (inkubálás kollagén „Morikrazoy” idő 24 óra). A nyíl jelzi a helyzetét a megfelelő sáv undefeated kollagén.
A kollagenáz gyógyszer hatására jelenlétében blokkolni egy endogén inhibitor arányban enzim: inhibitor nem kevesebb, mint 1: 100.
Amint a rajzból látható, csak akkor, ha az arány a hatóanyag „Morikraza”: inhibitor = 100: 1 van teljes gátlását a kollagenáz aktivitás valódi (lásd 5. és 6. sávban). A tisztaság a gátló szer a 2. sáv, ahol csak két intenzív fehérje-csíkot láthatóvá. Talán ez az izoforma az azonos inhibitor.
A javasolt módszer egy korábban ismeretlen endogén inhibitora kollagenolitikus enzimek hepatopancreasból király rák meglehetősen gazdaságos felhasználása révén a mikro-szűrési technikával egy speciálisan kiválasztott membránok. Ez jelentősen csökkenti az időben a folyamat, és csökkenti az előállítási költség egy inhibitor. Levezetése mikroszűrő membrán pórusméretű 100 kDa lehetővé teszi, hogy a kis molekulatömegű szennyeződések és kollagenolitikus enzimek teljes mértékben megőrzi inhibitort végre kisózás és a hatóanyag koncentrációját, ugyanabban a berendezésben, ami a tömény oldatok, a szárítási időt, amely jelentősen csökken. Kisózás fehérjék ammónium-szulfátos olcsó enyhén savas és semleges pH-segít megőrizni aktivitásának inhibitorok és olcsóbb eljárás. Továbbá, az ammónium-szulfát és acetát és extrakció és sózás inhibitor helyett az alkohol, aceton, triklór-ecetsav, alkalmazva egy prototípus, ami több, mint a környezet biztonságának a folyamatot, mivel oldatai ammóniumsók hígítás lehet használni növényvédő megtermékenyítés.
KÖVETELÉSEK
1. Eljárás egy kollagenáz inhibitor rák hepatopancreast fajokra, azzal jellemezve, hogy elvégezzük az homogenizáció nyersanyag 0,1 M ammónium-acetát tartalmazó 0,1-1 mM kalcium-acetátot pH = 6,4-7,0, a homogenizátumot centrifugáljuk, a felülúszót adunk szulfátot ammónium 60-70% -os telítettség enzimek kapott komplexet centrifugálással elkülönítjük, az utóbbit feloldjuk desztillált vízben hozzáadásával 0,1-1 mM kalcium-acetát, így egy tiszta oldatot, amelyet tisztítás követ, koncentráció és sótalanítás enzimet Polyfiber membrán pórusméretű 100 kDa és mosás felülúszóját tartalmazó kollagenáz inhibitor, desztillált vízzel, majd melegítéssel 60-100 ° C-on, a csapadékot elválasztva centrifugálással és fagyasztva szárítás.
2. Eljárás 1. igénypont szerinti, azzal jellemezve, hogy a felülúszót desztillált vízzel mossuk, legalább 3-szor.
3. Eljárás 1. igénypont szerinti, azzal jellemezve, hogy a fűtés a felülúszót előnyösen 80-85 ° C-on 25-40 percig.