A enzimkészítmény hepatopankreászból kereskedelmi fajok a rákok és annak gyártási módszer
C12N9 / 48 - ható peptidkötések, például tromboplasztin, leucin aminopeptidáz (3.4)
A tulajdonosok a szabadalmi RU 2280076:
Pacific Institute of Bioorganikus Chemistry, távol-keleti Branch az Orosz Tudományos Akadémia (RU)
A találmány tárgya egy multienzim gyógyszerek tengeri állat anyagok és eljárások azok előállítására, és alkalmazhatók lehetnek a biotechnológia, az orvostudomány, kozmetikumok, állatgyógyászatban, mezőgazdaságban, a kutatás és a termelés a biokémiai reagensek. A készítményt úgy állítjuk elő, homogenizáljuk rák hepatopancreasnak célfaj puffer oldatok, szilárd részek eltávolítása centrifugálással a homogenizátumot flokkulációs kitozánnal lipidek. Továbbá homogenizátumot végzett centrifugálással tovább tisztítottunk. Ultraszűrés enzimkészítmény oldatot végezzük áteresztő membrán anyagot, amelynek a molekulatömege 15 kDa vagy annál kevesebb, és ezután a membránt, retardáló szer, amelynek molekulatömege 50 kDa vagy annál magasabb. Az oldatot tartalmazó enzimatikus aktivitását liofilizáltuk. A készítmény tartalmaz egy készítményt polyfermental metallozavisimye kollagenolitikus proteináz és amelynek molekulatömege kisebb, mint 30 kDa, ribonukleáz, dezoxiribonukleáz, foszfodiészterázok, foszfatázok, amilázok, lipázok és # X003B2; -glucanase. A találmány tárgya egy kiterjesztése multienzim arzenáljának gyógyszerek hozamának növelésére a enzimkészítmény növelésével az enzimmennyiség típusok a multienzim komplex (proteázok, nukleázok, lipázok és glikozidázok), növelve az aktivitás a hidrolázok, bővülő a lehetséges alkalmazási tartományát polyfermental hatóanyag a különböző iparágakban. 2 ZP f-ly.
A találmány tárgya egy multienzim gyógyszerek tengeri állat anyagok és eljárások azok előállítására, és alkalmazhatók lehetnek a biotechnológia, az orvostudomány, kozmetikumok, állatgyógyászatban, mezőgazdaságban, a kutatás és a termelés a biokémiai reagensek.
A rákfélék (rákok, rákok és a rák) egy testet hepatopancreasnak kombinálásával máj és a hasnyálmirigy. Mivel a jellemzői a tápegység Decapoda hepatopancreasnak nagy mennyiségben szekre-emésztő enzimek, amelyek hidrolizálják az összes osztályok természetes polimerek és széles specifitású és szokatlanul magas aktivitást. Hepatopancreast elérhető, olcsó és nem toxikus alapanyagok előállítására enzimkészítményeket. Abban a pillanatban tarisznyarák hepatopancreas izolált nagymértékben tisztított vagy homogén állapotban kollagenolitikus proteináz, aminopeptidáz, tripszin, elasztáz, és a Ca, Mg-dependens DNáz.
Ugyanakkor származó hepatopancreasból rákok sokenzimes készítmények tartalmazhatnak, mint általában, az azonos típusú hidroláz, nevezetesen kollagenolitikus proteináz. Alapján kollagénlebontó proteázok kifejlesztett sebgyógyító drogok „Kollalitin”, „Morikraza”, „Collazo”, „kollagenáz QC”.
Ismert előállítási eljárásait enzimkészítmények a hepatopancreas a kereskedelmi fajok a rákok:
1. Eljárás egy komplex proteolitikus enzimek, azzal jellemezve, homogenizáció nyersanyag vizes oldatban, és kicsapva a kívánt terméket ammónium-szulfát. A komplex enzim tartalmazza tripszin, karboxipeptidáz A és B, leucin aminopeptidáz, alkalikus és semleges proteáz [SU 546.648 A1, 15.02.77].
2. Eljárás egy komplex proteolitikus enzimek az emésztőszervek szárazföldi és tengeri állatok, amely egy komplex extrakciós az aprított szervek kalcium-klorid-oldat, a szilárd anyagok eltávolításával centrifugálás és mikroszűrő membránok. A terméket (proteolitikus komplex) tartalmaz lúgos, semleges és savas proteáz, tripszin, kimotripszin, kollagenáz [RU 2034028 C1, 30.04.95].
3. Eljárás enzim előállítására készítményt, amely egy enzimet kivontuk a fagyasztott királyrák hepatopancreasnak alkálifém-klorid-oldat; elválasztása a csapadékot áthaladva szűrők pórusmérete 10 mm, 0,5 mm és 0,1 mm; A mikroszűrő membránok 0,45 mikron pórusméretü; ultraszűréssel membránok 10 kDa limit átviteli. Az enzimkészítmény úgynevezett "Kollalitinom" tartalmaz kollagenolitikus proteázok [RU 2096456 C1, 20.11.97].
A hátránya ennek a módszernek az az eljárás időtartama, ami csökkenti a kitermelést és az aktivitás szintjét. A kollagenázt képviseli három izoenzim molekulatömegű tartományban 18 és 27 kD.
4. A találmány szerinti megoldáshoz legközelebb módszer, amelyet a műszaki lényege egy eljárás enzimkészítmény a rák hepatopancreasnak kereskedelmi fajok rendelkező kollagenolitikus aktivitás (kollagenáz). Az eljárás előírja, hogy a homogenizáció nyersanyag autolízissel pufferben megoldások, majd az elegyhez, hogy a homogenizátumot a kitozán oldatot a végső koncentrációja 0,01-0,4%, elválasztó oldhatatlan anyagot, és szekvenciális ultraszűrő enzimoldat első membránon vágási szálastakarmány molekulatömege 100 kDa vagy több, majd egy olyan membránon, vágási molekulatömegű anyagok 30 kD vagy kisebb, gyűjtése az enzim nem halad át a membránon. Az oldatot tartalmazó enzimaktivitást liofilizáltuk [RU 2039819 C1, 20.07.95).
Prototípus módszer meglehetősen egyszerű végrehajtás, nem hosszabbítják időben, nem igényel mérgező reagenseket. Azonban, a kapott készítmény prototípus módszer meghatározása csak egy típusú hidrolázok, nevezetesen kollagenolitikus proteináz.
Alapján e komplex a csendes-óceáni Intézet Bioorganic Chemistry gyógyuló sebek létre széles spektrumú „kollagenáz KK„, amelyben a kollagenáz képviseli legalább három izoenzim [RU 2093166 C1, 20.10.97].
Jelenleg hatálya méltó enzim komplex korlátozott, csak az a képessége, hogy fehérjéket lebontani. Ugyanakkor sok esetben a sikeres megoldását sajátos probléma használatát igényli multienzimet készítmények széles spektrumú aktivitást. Például, hogy hajtsák végre a teljes enzim az állati és növényi sejtek alkalmazásával hidrolízis degradációs termékek a biotechnológia, az élelmiszer és a mikrobiológiai ipar.
A célunk a találmánnyal -, hogy hozzon létre multienzim előállítására hidrolizálni képes 4 osztályú természetes biopolimerek, mint például a fehérjék, nukleinsavak, poliszacharidok és lipidek azzal a céllal, hogy szélesebb körű és hatásosabb alkalmazását; bővíteni a arzenáljának komplex nyert enzimkészítmények hepatopancreasból kereskedelmi fajok a rákok és dolgozzon ki egy eljárás annak előállítására.
Ennek eredményeképpen, új multienzim gyógyszer oldatokat a probléma létrehozott tartalmazó kollagenolitikus proteináz, amely a találmány szerint tartalmaz továbbá metallozavisimye proteázok, ribonukleáz, dezoxiribonukleáz, foszfodiészterázok, foszfatázok, amilázok, lipázok és # X003B2; -glucanase. Ezt homogenizálásával készítjük hepatopancreasból kereskedelmi állatfajok rák a puffer oldatok, a A szilárd halmazállapotú szennyezőanyagok homogenizátumot centrifugálással, flokkuláció lipid kitozán ultraszűréssel enzimkészítmény az oldat a membrán permeábilis anyag, amelynek a molekulatömege 15 kDa vagy annál kevesebb, és ezután a membránt, retardáló szer, amelynek molekulatömege 50 kD és fent.
A műszaki hatás biztosítja az a tény, hogy az új enzim komplex készítmény 4 típusú hidroláz - proteázok, nukleázok, lipázok és glikozidázok, azaz van egy szélesebb spektrumú enzimaktivitások összehasonlítva az ismert készítmény, amelynek csak az egyik típusú hidroláz aktivitást, nevezetesen - kollagenolitikus.
A kapcsolat a fenti javasolt multienzim készítmény használható a gyakorlatban a nagyobb hatékonyságot, mint a technika állása. Például, ha a hatóanyag a gyógyászatban kezelésére nekrotikus folyamatok által okozott bakteriális vagy vírusos fertőzés, ez a hatékonyság nyújt egyedülálló kombinációját litikus hatását kollagenázok, proteázok és nukleázok és antivirális hatását a DN-áz és az RNáz.
Továbbá, a javasolt összetett szolgálhatnak forrásként hagyományos biokémiai módszerekkel egyes enzimek vagy enzim komplexeket irányított művelet, például DNáz és RNáz komplex. A együttes jelenléte a javasolt enzimkészítmény DNáz és RNáz teremtenek a gyógyászat, állatgyógyászatban, mezőgazdaságban, a vírusellenes szerek, amely biztosítja a képességét, hogy egyidejűleg gátolják a szorzás a DNS-t és RNS-vírusok emberek, állatok és növények.
Új gyógyszer kiterjeszti a arzenáljának komplex enzimkészítmények.
A feladat megoldható továbbá eljárás termelő enzim készítmény, amely kollagenolitikus proteináz, amely homogenizáló hepatopancreasnak halászati rák fajok, a mellett, hogy a homogenizátumot a kitozán oldatot, elválasztják az oldhatatlan anyagot, majd ultraszűréssel a kapott oldathoz, és a kívánt terméket liofilizálással, amelyben, a találmány szerint a homogenizátumot további tisztításnak vetjük alá centrifugálással, és az ultraszűrést végzünk áteresztő membrán anyag egy molekuláris sósav tömege 15 kDa és alatt, összegyűjtjük a enzimkészítmény nem halad át a membránon. Ezután a kapott enzim-koncentrátum készítmény, amely 4 típusú hidrolázok a membránon átmentek, retardáló szer, amelynek molekulatömege 50 kDa vagy annál magasabb. Ennek eredményeként, a készítmény tartalmaz továbbá kollagenolitikus proteináz metallozavisimye és amelynek molekulatömege kisebb, mint 30 kDa, ribonukleáz, dezoxiribonukleáz, foszfodiészterázok, foszfatázok, amilázok, lipázok és # X003B2; -glucanase.
A módszert úgy hajthatjuk végre alacsony hőmérsékleten, például 5 # x000B0 C (egy hideg szobában), valamint szobahőmérsékleten.
A homogenizátumhoz kitozánt adunk a szerves vagy ásványi savval képzett sók formájú oldat formájában. Bevezetése további tisztítási lépések centrifugálással A homogenizátum koncentrációjának csökkentésére egészen 0,001% kitozán, ami viszont csökkenti a veszteséget kapcsolatos protein szorpciós a fehérje a kitozán, ennek eredményeként - növeli a hozamot az enzim komplex.
Az 50 kD alatti áttűnésű membránok használata lehetővé teszi 50 kD fölötti molekulatömegű ballaszt-biopolimerek eltávolítását, és ezáltal növeli a komplexben jelen lévő enzimek specifikus aktivitását.
A sajátosságok összességét, amelyek a találmány szerinti eljárás biztosítja a műszaki eredmény, amely abban áll, egyre nagyobb a hozam a enzimkészítmény növelésével az enzimmennyiség típusok a multienzim komplex (proteázok, nukleázok, lipázok és glikozidázok), és aktivitásának fokozására hidrolázok.
A találmány példakénti kiviteli alakjai
80 g komplex enzimkészítményt kapunk. A gyógyszer 0,8 mg fehérjét tartalmaz a hatóanyag per mg-jára. A készítményben lévő lipidek hiányoznak.
2. példa rák hepatopancreasból célfaj (10 kg) megőrölünk, és helyezzük 30 liter vizet, a pH a bikarbonát-oldattal, hogy a értéke 8,3 és alatt tartottuk keverés közben 6 órán át 5 ° C # x000B0;. Az oldatot ezután 3000 g-ban centrifugáljuk, és a kitozán 0,5 N koncentrációjú oldatát adjuk a felülúszóhoz erőteljes keverés közben. hidrogén-kloriddal, a kitozán végső koncentrációját 0,001% -ra, az oldat pH-ját flokkulációban (7,0). Az eljárást ezután az 1. példában leírtak szerint végezzük pufferoldatban, pH = 8,3.
78,0 g komplex enzimkészítményt kapunk. A gyógyszer 0,85 mg fehérjét tartalmaz a hatóanyag 1 mg-ánál. A készítményben lévő lipidek hiányoznak.
7,2 g komplex enzimkészítményt kapunk. A gyógyszer 0,75 mg fehérjét tartalmaz a hatóanyag 1 mg-ánál. A készítményben lévő lipidek hiányoznak.
7,4 g komplex enzimkészítményt kapunk. A gyógyszer 0,78 mg fehérjét tartalmaz a hatóanyag per mg-jára. A készítményben lévő lipidek hiányoznak.
Az igényelt eljárással kapott enzimkészítménynek az alábbi jellemzői vannak:
por sárgás-szürke színű, desztillált vízben vagy pufferoldatban oldva, enyhe szaggal; a készítmény nem tartalmaz nehézfémeket, szennyeződéseket, ártalmas és mérgező anyagokat; a készítmény gyakorlatilag nem veszíti el tevékenységét 4 év elteltével fagyasztva szárított állapotban, + 10 ° C-on;
specifikus kollagenolitikus aktivitás (I típusú kollagén) nem kisebb, mint 1,5 U / mg hatóanyag / perc (meghatározása specifikus kollagenolitikus aktivitás végzi eljárással 123.12.002-92 MA);
specifikus aktivitása tripszin-szerű proteázok (N-benzoil-arginin-p-nitroanilid) nem kisebb, mint 3,3 U / mg hatóanyag / perc (meghatározását proteináz aktivitás által végzett Erlanger módszer);
specifikus teljes proteolitikus aktivitást (kazein) nem kisebb, mint 0,7 U / mg hatóanyag / perc (meghatározását a proteolitikus aktivitás által végzett standard eljárásokkal összhangban GOST 20264,2-88);
az alkalikus RNáz specifikus aktivitása nem kevesebb, mint 35 U / mg gyógyszer / óra;
a savas RNáz fajlagos aktivitása nem kevesebb, mint 10 U / mg gyógyszer / óra;
A specifikus DNáz aktivitás nem kevesebb, mint 400 U / mg gyógyszer / óra;
az alkalikus foszfatáz fajlagos aktivitása nem kevesebb, mint 0,04 U / mg gyógyszer / perc;
a lúgos és savas foszfodiészterázok fajlagos aktivitása nem kevesebb, mint 0,003 U / mg gyógyszer / perc;
specifikus tevékenység a glukanáz nem kevesebb, mint 0,01 U / mg gyógyszer / perc;
a specifikus amilázaktivitás nem kevesebb, mint 0,01 U / mg gyógyszer / perc;
specifikus lipázaktivitás nem kevesebb, mint 250 U / mg gyógyszer / perc.
Az enzimaktivitás meghatározását a Sigma katalógusokban megadott módszerekkel végezzük.
A kutatás során azt találtuk, hogy a legnagyobb aktivitású komplex enzimek molekulatömege 15-42 kDa. A komplex legaktívabb összetevői a szerin-kollagén-liti-kus proteinázok, metalloproteinázok, lúgos DNáz, lúgos és savas RNáz, amiláz.
1. Eljárás egy enzimkészítmény a rák hepatopancreasnak kereskedelmi fajok tartalmazó kollagenolitikus proteináz, amely homogenizáció kereskedelmi rák hepatopancreas pufferoldatban, oldat hozzáadásával kitozán savas, elkülönítjük az oldhatatlan anyagot, majd ultraszűréssel a kapott oldatot a liofilizálás és a kívánt terméket, azzal jellemezve, hogy a homogenizátumot vetjük alá további tisztítás centrifugálással és ultraszűrést végeztünk egy membránon, permeábilis eschestva molekulatömegű 15 kDa és alatt, összegyűjtjük a enzimkészítmény nem halad át a membránon, és ezután koncentráljuk, és sómentesített extraktumot áthalad a membránon, retardáló szer, amelynek molekulatömege 50 kDa és a magasabb, olyan készítmény előállítására, amely tartalmaz továbbá metallozavisimye proteázok, ribonukleáz, dezoxiribonukleáz, foszfodiészteráz, foszfatáz, amiláz, lipáz és # x003B2; -glukanáz.
2. Az 1. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy homogenizálást és tisztítást végzünk az 5,5-9,5 enzimoldat pH-ján és 5-20 ° x000Bo hőmérsékleten;
3. Az enzim előállításánál a rák hepatopancreasnak kereskedelmi fajok tartalmazó kollagenolitikus proteináz, azzal jellemezve, hogy tartalmaz továbbá metallozavisimye proteázok, ribonukleáz, dezoxiribonukleáz, foszfatázok, foszfodiészterázok, amiláz, lipáz és és az 1. vagy 2. igénypont szerinti eljárással állítjuk elő.