Kémiailag kompetens sejtekbe lehet transzformáltunk a ligációs keveréket nyers (és általában a DNS található, mérsékelten pufferolt sóoldat). A sejtek száma egy kémiailag illetékes csomagolás jelentősen kevesebb, mint elektrokompetensE, így az egész csomagolási lehet bevonatú csészénként.
Előállítása kompetens sejtek.
Photo (-70 ° C) diszpergáljuk a baktériumok szelektív közegre csésze;
37 o C-növekedni, ON;
Számos telepet (10-12) átmérőjű
2-3 mm helyezünk egy lombikba 40 ml SOB 0.5-1.0L.
intenzíven rázás (200-300rpm)
* Vagy 37 ° C - átlagos szintű szakértelem, de az idő rövid,
* Akár 18 o C (átrendeződik egy hideg szobában rázógépen) - kompetencia fenti, de a növekedés ideje - több nap;
Minden további átalakításokra került sor a hideg.
50 ml CF-cső fel 30ml kultúra;
0 o C, 10-15 „;
DF 2-3krpm 4 o C, 10”, a felülúszót leszívatjuk;
ZF 2-3krpm 4 o C, 20 '', óvatosan távolítsuk el maradék folyadék;
szuszpendálunk 10 ml TB;
0 o C, 10-15 „;
ismételje igénypont 7, 8;
újra szuszpendáltuk 2 ml TB;
+ DMSO-ban, 3,5% (70μl);
0 o C, 10-15 „;
ismételje p.14,15;
razalikvotit 100 yd be hűtött 2 ml menetes kupakkal;
folyékony nitrogénben lefagyasztjuk;
tárolás folyékony nitrogénben (jobb) vagy a -70 ° C-on
készített 100X Photo (0,5 jig / ml) friss oldat pDNS 5 ng / ml;
0,5 M bMeEtOH jégben felengedtetünk, és egy alikvotot a sejtek;
hozzá egy aliquot kompetens sejtet:
4 pl 0,5 bMeEtOH,
2 pl (10 ng) pDNS;
0 o C, 20-60 „;
42 o C, 30 '', rázás nélkül;
egyszer jég, 2 ';
+ 400 ul SOC;
szűk csavaros kupak, rázzuk vízszintesen egy bakteriális rázógépen 37 o C-on, 30 „;
koca 50 lambda egy csésze egy antibiotikum;
növelhető, ha "N" telepek, a kompetencia Nh10 = 6 [telepet / ug].
- hasonló „ellenőrzés”;
- Egy aliquot lehet venni az összeg a pDNS o C (titer nem változik). A következő napon, kiszámítja a sejtek száma a vetés, koca.
10%.Átalakítás frekvencia állandó a
10 ng pDNS / 100 ni sejtek, majd nagyon gyorsan csökken.
Telítettség a területen 100-200ng / 100 ni sejtek.
> 25 ng / 100 jil sejtek - egy érzékelhető gyakorisága kettős transzformánsok jelennek meg.
Abban az esetben, nagyszámú egyszerű transzformációk (például klónozó plazmidok) működését jelentősen lehet gyorsítani, ha (i) az átalakulás, hogy egy kis mennyiségű sejt (
20 ul), (II) kitisztítottuk után azonnal hősokk nélkül ( „ébredés”).
Azt olvastam és hallottam egy teljesen más nézeteket követelmények a minőségi DMSO. Ezért minden esetben használjuk a „Sigma, # D2650”, csomagolt argonatmoszférában (alikvot ampullákban 5 vagy 10 ml). Fasuem egyszer, és tárolja a csomagolás -70 ° C-on
A fő előnye a kémiailag kompetens sejtek előzetes elektrokompetens:
- Kémiailag kompetens sejtekbe lehet transzformáltunk a ligációs keveréket nyers (és általában a DNS található, mérsékelten pufferolt sóoldat). Abban az esetben, elektrokompetens - DNS tisztítani kell, mivel (I) túl magas sókoncentráció okozhat egy szikra kisülési a sejtben (ii) ha a héj elektrotransformatsii E. coli lyukak jelennek meg, képesek áthatolni az alkalmazott enzim ligáláshoz.
- A sejtek számát az elektro-csomagolás lényegesen több, mint a kémiailag kompetens, ezért ne próbálja vetni egy csésze túl nagy részesedést csomagolás. Ez tele van aljnövényzet (Advent a műholdas telepek), valamint csökkent a kompetencia.
Növekedés 37 o C-on vezet éles (akut maximum) függően hatáskörébe a sejtsűrűség (A600 = 0,45 DH10B). A 18 o C-kal magasabb kompetencia elérni egy széles A600 = 0,35-0,70.
Kommunikáció sejtkoncentráció egy optikai sűrűség: OD550 = C [sejt / ml] * augusztus 10 / K.
PIPES részeként TB lehet helyettesíteni HEPES vagy BES. Ez csak akkor vezet egy kis csökkenés hatáskörébe tartozik. Transzformációs hatékonyság gyakorlatilag állandó tartományban pH 5,6-7,0, azonban, pH> 7,0 MnCI2 kicsapódik.
DMSO nagy koncentrációban mérgező a baktériumok (Ez lehetővé teszi nem törődnek annak sterilitását), ezért hozzáadjuk a sejtekhez a két fázisban. Sőt, jobb hozzá oly módon, hogy elkerüljük olyan területek „magas koncentráció” (de tipchika vége belemerül a sejtszuszpenzió nem lehet - DMSO megfagy és eltömítheti típus). Vagy csepegtetünk állandó keverés közben, vagy a fel (ahol fagyasztva DMSO) hűtött cső fala, amelyből öblítse, keverés cső.
A csövet kell műanyag, a használata az üveg csövek csökkentheti a hatékonyságot körülbelül 10-szer (feltehetően azért, mert DNS adszorpciója üveg).
Fagyasztás folyékony nitrogénnel (hideg sokk) javítja kompetencia 4-5 alkalommal.
Effect plazmid mérete a transzformációs hatékonyság: moláris frekvencia lényegében állandó méretek
Heat shock: A hőmérséklet lehet tartományban 40-50 o C
Leírták, hogy ha a hősokk cserélje ki a „cseppfolyós nitrogénben megfagyasztjuk, (1„), a felolvasztás (maximum NT)”, a növekedés kompetencia
Kapcsolódó cikkek