Géntechnológia - típusú vektorok a gén bejuttatását a sejtbe (bakteriális plazmidok, vírusok,

Egy gén egy sejtbe

A típusú vektorok bevezetésére Egy génnek egy olyan sejt

Számos típusú vektorok:

A nagy részét a celluláris DNS-baktériumok szereplő kromoszóma (kromoszóma E. coli-ban, például 4 Mill. Bázispár). Azonban, eltekintve a bakteriális kromoszóma tartalmaz egy nagyszámú, igen kis kör alakú molekulák DNS-plazmidokat hossza néhány ezer bázispár (molekulatömeg 1,5 és 300 megadaltonos, MD 1 = 1500 bp). Ezek a mini-kromoszómák úgynevezett plazmidok.

Jellemzően, plazmidok állnak az antibiotikum rezisztencia gének, nehézfém-ionok (R-plazmidok), valamint a szabályozó gének katabolizmusát bizonyos szerves vegyületek (plazmid biodegradáció vagy D-plazmid). Mivel ezek a gének találhatók plazmidok, ők képviselik sokkal nagyobb példányszámot. Nagy kópiaszámú plazmidok olyan sejtet biztosít szintézisét nagy mennyiségű enzimeket, antibiotikumokat vagy kémiailag semlegesítő xenobiotikumok, és amely rezisztencia az utóbbi. A plazmidok, láthatóan mindenütt jelen, mivel ezek izolált különböző törzseivel és baktériumfajt, de opcionális komponensek a genom, és egyes törzsek természetes plazmidok nem talált egyáltalán.

Mivel a plazmid DNS-t sokkal kevésbé kromoszómán, ez elég könnyen izolálni tiszta formában. A plazmid jelenlétét kalcium ionok könnyen felszívódik a baktériumok a címzett, akkor is, ha soha nem tartott, és a sejtekben a bakteriális utódok megtalálható sok példányban a felszívódott plazmidot. Azonban, általában egy bakteriális sejt tartalmazhat a szerkezetében egy típusú plazmidot. Ez a jelenség plazmid összeférhetetlenséget. Vannak inkompatibilitási csoport - Inc-csoport (az angol inkompatibilitás - inkompatibilitás). Ilyen csoport lehet több plazmidok, amelyek kompatibilisek egymással, de nem kompatibilisek más plazmidokba. Ezek a plazmidok hasonló sok tüneteket, és gyakran jelentős homológiát DNS-t.

A száma plazmid kópia sejtenként lényegesen változtatható. Attól függ, hogy a genetikai jellemzői a sejtek és a plazmid. A plazmidokat „alatt laza ellenőrzés”, tud szaporodni, amíg számuk eléri a 10-200 példányban cellánként. Ha a plazmidot „szigorúan ellenőrzött”, ez reprodukálni ugyanolyan sebességgel, mint a fő kromoszómán. Ilyen plazmidok a sejtben lévő egy vagy néhány példányban. Természetesen, a klónozását rekombináns DNS-plazmidokat hajlanak arra, hogy az első típusú. De ez nem szükséges, mivel a plazmid kloramfenikol jelenlétében lehet szorozni függetlenül kromoszóma részlege, és a másolatok számát a plazmid lehet ismételten növekedett.

Az egyik leggyakrabban használt klónozó plazmidok a pBR 322 alapja egy természetes plazmid az E. coliból izolált. Ez a plazmid gének szembeni rezisztencia két antibiotikum: ampicillin és tetraciklin rezisztencia gének és a rezisztencia ezekkel az antibiotikumokkal vannak restrikciós helyek. Ha egy fragmense idegen DNS integrálódik az egyik rezisztencia gének, az utóbbi inaktiválódik. Ennélfogva a sikeres beépülése az idegen DNS-fragmens az egyik ilyen gének könnyen kimutatható a eltűnése bakteriális rezisztencia erre az antibiotikumra. De miközben más antibiotikumokkal szembeni rezisztenciát. A vektor így lehetővé teszi, hogy észleli csak a bakteriális klónokat, amelyek tartalmazzák a rekombináns plazmidot.

Vannak olyan vírusok, amelyek nem vezetnek a sejthalált, hanem beépül a genomba a gazdasejt és szaporodnak vele, vagy elvesznek a kontrollálatlan növekedést, azaz, alakulnak rák. Ezek közé tartozik a DNS-SV-40-vírus és a polióma vírus. A bevezetése néhány tumor RNS-vírusok vezet a bimbózó vírusrészecskék sejtiizáiás nélküle. Ezek a vírusok, például retrovírusokat (Rous szarkóma vírus és az AIDS). A bakteriális sejtek, mint vektoron, gyakran használt bakteriofágok.

A vírusok egyik fő jelölt a szerepét vektorok idegen DNS. Ha vírusfertőzés, mindegyik cella kaphat nagy példányszámban az idegen gén. DNS illeszthető úgy, hogy szabályozás alatt volt, egy erős virális promoterek, amelyek magas szintű gén expressziójának és a termékek szélesebb körben kutatható.

Az utóbbi években számos tervezett „ingázó” vektorok, és azok rekombináns származékok, amelyek képesek replikálódni egy állati sejtben, és a bakteriális és hatékonyan kifejezni a klónozott gént egy állati sejtben. A leggyakoribb vektorok állnak pBR322 plazmid és az ép korai régió SV40 DNS transzkripcióját, a gén integrált szabályozása alatt egy adott promoter vagy késői gének további korai promóter. Például, a gént inszertáltuk SV40 DNS # 946; nyúl globin, amely kifejeződik majom-sejtvonal rekombináns vírussal infektált: szintetizált sejtek és globin mRNS, és magának a fehérjének.

A vírus életképesnek kell lennie után rekombináns DNS. A legegyszerűbb módja annak, hogy vezessenek be a vírusok baktériumok. A hátránya, virális vektorok, mint az, hogy kis kapacitású. Ezen túlmenően, a vírus megfertőz egy kis kört a tulajdonosok.

Vannak tartalmazó hibrid vektorok DNS-fág és plazmidok. Ezek közé tartozik, például, kozmidok és phasmids.

A kozmidok - plazmid vektort, amelybe be integrált fág genom részét # 955;, biztosítva annak lehetőségét, csomagolás a DNS-molekula a fág részecskék. Fágrészecskéket a jó behatolást hibrid DNS sejtbe (injekcióban) zárása előtt történik gyűrűben DNS ragadós végeket és az ismétlés a plazmid típusától.

Fazmid is közötti hibridek fág és a plazmid. Beépítése után idegen DNS bizonyos körülmények alakulnak ki fágok más - például a plazmidok.

Az összes jelenleg ismert fertőző ágensek rangot legtöbb országban. Ismeretes, hogy a legkisebb vírusok önálló replikációra képes, genom mérete is megfelelő a molekulatömege 1 M, azaz mintegy 1500 ezer. Bázispár. Úgy ítélték meg, minimális mennyiségű genetikai információ szükséges kódolás termékek és vírus-gátló gazdasejt anyagcseréjét.

Azonban, 1971 godu fertőző ágensek már kinyitott, nagyon rövid láncú 1 szálú RNS kovalensen kapcsolódik egy gyűrű, amely a nukleotidok 270-300 (három nagyságrenddel kisebb, mint a legtöbb minimális vírus) nem zárt egy fehérje kabátot. Ez a szokatlan kórokozók - a legegyszerűbb és legkisebb az összes ismert.

Hogyan viroidokat tüneteket a fertőzött növények, nem ismert eddig. Megállapítást nyert, hogy megismételték a enzimeket a gazdasejt, sugárzása nem fajspecifikus polipeptidek integrálódik a gazdasejt genomjába.

Viroidokat megfertőzni persisitentno (hasznosítás nem fordul elő). Ok szisztémás fertőzés, azaz a vándorolnak a helyén bevezetése más részein a növények át mechanikusan vagy a cellán keresztül nedv magokon keresztül, a pollen. Viroidok is társul nukleáris frakciókban növények és nőhet a sejtmagban.

Amikor dolgozik viroidokat, 1-szálú DNS-másolatát az RNS komplementer szálat, és, hogy kész a kapott 2-szálú DNS viroid. Az ilyen 2-vctraivaetsya szálú DNS-t egy plazmid, és bevisszük E. coli sejtek a klónozáshoz. Reading kezdődik a gén promotert, amelyet felismer egy olyan RNS-polimeráz felelős a DNS átírását RNS-mátrixszal. Jellemzően, ezt a DNS-fragmenst 41-44 bp. Gene olvasható balról jobbra, 5 „és 3” végén a gén és a végén véget gén tartományába. Promoter transzkripciós starthely kezdődik, ezt követi a szemantikai gén részét. A promoter régió gén kombinációját tartalmazza bizonyos rövid nukleotidok specifikus bakteriális gének, vagy gének a magasabb rendű szervezetek. Az ilyen kombinációk jelek az RNS-polimeráz, amely csatlakozik a promoter szakaszát a gén, és elkezdi olvasni.

Az egyszálú és a kétszálú DNS kezdeményezheti viroid replikáció dohánynövényekben beoltott mechanikusan. In vitro enzimatikusan szintetizált RNS, mint viroidokat, erősen fertőző a növényeket. Vektor rendszer alapján tervezett RNS önmagában, alapú viroidospetsifichnyh DNS, valamint kombinálva Ti viroidospetsifichnyh DNS -plasmids. Viroidokat megfertőzheti házigazdák életciklusuk során, így abban az esetben viroid vektor rendszer várható konstans kifejezés egy idegen gén a növény.

Mivel a vektorok is alkalmazhatók opuholeobrazuyuschie bakteriális plazmid. Agrobacterium típusú evolúciós rokonságban góc baktériumok nemzetségbe tartozó Rhizobium, és sok közös vonása van a számukra. Azonban a kölcsönhatás természetének Agrobacterium az üzem sajátosságaihoz.

Kölcsönhatás fajok Agrobacterium a növényeket különösen érdekes, mivel amikor az ilyen típusú parazitizmus egyik partner specifikusan módosítja a tulajdonságait a fogadó beiktatásával génjeik a genomjába. Ezen túlmenően, ez szolgál egy egyedülálló példa a prokarióta DNS-migráció az eukarióta sejtben. A mitokondriális DNS és kloroplaszt, kloroplasztisz és a mitokondrium tartalmaz teljes genetikai rendszere, azaz az összes szükséges elemek a genetikai információ kifejeződése: DNS, DNS-polimeráz, RNS-polimeráz és a protein-szintetizáló gépek (riboszómák, tRNS-ek, amino-acil-tRNS-szintetáz).

A kloroplasztisz és a mitokondriális DNS is vonzza a figyelmet a tudósok, mint lehetséges vektorok géntranszfer sejtbe. A szervezeti felépítését ezen celluláris subgenomes jelentősen változik.

Kloroplasztiszok és egyéb plasztiszokba ugyanazt a genetikai információt, úgynevezett plasztóma. A magasabb rendű növényekben, ez egy zárt DNS-molekula 150 m. N. n. kódolására elegendő fehérjék körülbelül 100. A szintézishez a plasztid fehérjét kell lényegesen nagyobb. A többi fehérjéket kódolja a mag, szintetizáljuk a citoplazmában, és adja meg a kloroplasztok. Néhány a legfontosabb kloroplaszt fehérjék állnak több alegység, egy részük szintetizált riboszómákon a citoplazma és szállítják a kloroplasztba, ahol azok más kódolt polipeptidek a kloroplaszt és azonos szintetizált. Így a bioszintézisét funkcionálisan aktív kloroplaszt genomba igényel összehangolt expressziója és plasztom.

Különböző típusú plasztiszokba tartalmaz egyenlő számú azonos másolatait plasztóma: 10-20 példányban plasztiszaiban gyökerek és érett kloroplasztiszok száz példányban fiatal burgonya kloroplasztokat. Az ilyen erősítést ad reményt megbízható idegen DNS expresszió alkalmazásával őket vektorok génsebészeti kísérletek. Továbbá, plasztid riboszomális RNS-gének és a nagy alegység rubisco kódolt kloroplaszt genomba. Lehet, hogy a bevezetése erős promóterek a gének és a további módosítással ezek jelentős hatást gyakorolnak a fotoszintetikus aktivitás a növényi szövetek.

A növényi gének is képesek expressziót E. coli sejtek. Ez egy nagy gének subedintsy rubisco. A kloroplasztisz gének előnye abban a tényben rejlik, hogy a kifejezést, hogy E. coli sejteket a érhető el egyszerűen kombinálja átíródó szekvenciákat, például a DNS kloroplasztisz és baktériumok előtt a transzlációs start kodon azonos nukleotid szekvenciát. Ez lehetővé teszi, hogy szintetizálni gazdaságilag fontos növényi polipeptidek alkalmazásával prokarióta sejtek.

Ezzel szemben a kloroplaszt, mitokondriális DNS jellemzi rendkívül változatos és értéktartományok 200-2400 m. N. n. Azonban, nincs összefüggés a méret a mitokondriális genom és a szám a fehérje termékek által szintetizált izolált mitokondriumok, nem figyelhető meg. Ez a jelenség, valamint a nagy méretű mitokondriális DNS, úgy tűnik, azzal magyarázható, hogy a DNS jelenléte, haszontalan működéséhez mitokondrium.

Ennek része a mitokondriális DNS, a strukturális polipeptideket kódoló gének, gének, riboszomális és transzfer RNS. Azonban, a legtöbb a fehérjék a mitokondriumok, kloroplasztok által kódolt nukleáris gének. De ha a kloroplasztisz genom által képviselt homogén népesség nagy gyűrű molekulák a mitokondriumban több osztályt tartalmaz gyűrű molekulák, nem minden funkció még nem tisztázott.

A mitokondriális genom az élő szervezetek sokkal alacsonyabb 15-19 m n .. o., és több konzervatív szerkezetet. A mitokondriális gének kódolják két csoport karakterek - a munka légzőrendszer és az antibiotikumokkal szembeni rezisztencia és más mérgek. A mitokondriális genom a növény is vannak gének jele hímsterilitás citoplazma.

A transzpozonok - DNS-szegmensek, amelyek szabályozzák saját átültetés (mozgása) a DNS-t az egyik oldalon a másik kivágásával az eredeti helyén, és bevezetése egy új helyén a kromoszómában vagy a plazmidban. Azt fedezték fel a 40-es évek amerikai tudós Barbara McClintock kukoricában. Ezek a gének indentifitsirovannye képességükre, hogy elnyomja a más gének kifejeződését kukorica, közel hozzájuk, nincs fix helyzetben a kromoszómán. Úgy tűnik, hogy lehet mozgatni az egész növény genomjában. A szabályozó elemek is be lehet meríteni és a hasított, és a kimetszés után gyakran kezd működni korábban csendes gének.

Azt találtuk, hogy összefüggő géneket szabályozó elemek instabillá válnak, és gyakran mutáns, mert a bizonytalanság ezen elemek magukat. A kukorica volt az egyetlen rendszer, sok éven át, amely érzékeli a mobil genetikai elemek. Most - és baktériumok, Drosophila és más élőlények.

Mozgás mechanizmusa DNS-fragmensek a genomban nem teljesen ismert. A DNS-t átvittük az enzim transzpozáz. Az enzim által kódolt szekvencia körülbelül 20 nukleotid közepén a transzpozon. Ő kifejezetten kölcsönhatásba terminális fordított ismétlődések mobil elemek, és vágja le a kromoszómán. Vágási kerülhet sor pontosan - a hasznosítás az eredeti szerkezet a DNS rész és pontatlan, vagyis deléciók és inszerciók egy vagy számos nukleotiddal. Ez vezet a megjelenése stabil mutációkat, és az egyik új DNS-szekvenciák mechanizmusok.

Jellemzően mobilis genetikai elemek sokszor megismétlődik, a genomban képeznek heterogén család, amelynek tagjai eloszlik a kromoszómák. A legtöbb tagja a család minden hibás másolatok, és nem tartalmaz olyan funkciót, de megtartják a mozgásképesség. A viselkedése transzpozonok úgy tekinthetők, mint parazita. A hossza 2 és 10 tysyach nukleotid-pár. A magasabb rendű eukarióták, transzpozonok szerint megközelítőleg 10% -a a sejt DNS-t. Legtöbbjük át időről időre, de mint a ketrec sok átültetést jelentős hatással a fajok sokféleségét.

A biológiai jelentősége mozgásának egyes DNS szegmensek:

- megszakítja a gén, ami a fejlődése;

- A génaktivitás szabályozása, mivel a transzpozonok hordozhat jeleket Start állása géneket. Az új területek megerősítése, illetve megtilthatja a működését a gént.

Transzpozonok is részt vesznek horizontális gén transzfer.

A baktériumok, a 2-es mobil gént azonosítottak, amelyek különböznek a hossza és összetettsége a szervezet.

1. inszerciós szekvenciákat vagy 1S elemeket, amelyek hossza körülbelül ezer nukleotid bázispár, és amely csak a gén felelős azok mozgását.

2. transzpozonok és hossza 3-20 m. N. n., amely számos további résztvevő gének bakteriális rezisztencia a különböző toxikus anyagokat.

Mivel mozgó gének mozoghat a genomon belül egyik helyről a másikra, nagyon hatékony lehet vektorok átadása rekombináns DNS-t. Genetikai transzformációs vektorokkal alapuló transzpozonok először végzett Drosophila. A Drosophila transzponálható elem P vittük gént, amely termel a barna szem színét. Géntranszfert transzpozonok révén nagy előnye, ahogy ez történik a magas frekvenciájú, és nem jár jelentős átrendeződések integrálható DNS-t. Továbbá, ez a módszer lehet mozgatni elegendően nagy DNS-fragmensek.

További fejezetek ez a rész: