rögzített enzimek
Az egyik enzim Engineering feladata, hogy egy olyan technológia kifejlesztése a termelés és az immobilizált enzimek használata. Az immobilizált enzimek nevezzük enzimek, mesterségesen társult az oldhatatlan hordozó, de megtartja a katalitikus tulajdonságait. Ez a tendencia a biotechnológia indult 1916-ban, amikor Dzh.Nelson és E.Griffin adszorbeáltuk szén és invertáz azt mutatta, hogy ő tartja oly módon, katalitikus aktivitást.
Jelenleg a „immobilizáció” hogy egy tágabb értelemben vett - teljes vagy részleges korlátozás a szabad mozgását fehérjemolekulák.
Az immobilizált enzimek számos előnnyel képest szabad molekulák:
· Heterogén katalizátorok könnyen elválasztható a reakció közeg, mely lehetővé teszi, hogy a reakció leállítása bármikor, hogy az enzimet ismételten használhassuk, és kap egy tiszta termék az enzim;
· Ismételten fel lehet használni, és a folyamatosság katalitikus folyamat;
· Tulajdonságait megváltoztatja, szubsztrát specificitás, a stabilitás, a tevékenység függés környezeti paraméterek;
· Tartós az ezer és tízezer szer stabilabb, mint a szabad enzimek.
Az összes fenti biztosítja a magas hatékonyság, az eredményesség és a versenyképesség technológiák segítségével rögzített enzimek.
Mindkét enzim lehet immobilizált kötődve az oldhatatlan hordozó, és intramolekuláris vagy intermolekuláris térhálósodás a fehérje molekulák kis molekulatömegű difunkciós vegyületek, valamint azáltal, hogy összekapcsolódik az oldható polimer.
Hordozók enzimek immobilizálására. A média meg kell felelniük az alábbi követelményeknek:
· Nagy kémiai és biológiai stabilitását;
· Nagy kémiai tartósság;
· Megfelelő permeabilitás, hogy az enzim és a szubsztrát, a porozitás, nagy felületű;
· Lehetőséget, hogy egy technológiailag kényelmes formáihoz (szemcsék, membránok);
Előállításához immobilizált enzimek használják korlátozott számú mind szerves, mind szervetlen hordozóanyagokat (ábra. 7.1).
Ábra. 7.1. Osztályozása hordozók immobilizált enzimek
A szerves polimer hordozók. Meglévő szerves polimer hordozók lehet osztani két osztályba: természetes (fehérje, poliszacharid és lipid) és szintetikus polimer hordozók (polimetilén, poliészter és poliamid).
Előnyei természetes hordozók. a rendelkezésre álló, többfunkciós és hidrofil; Hátránya: magas költség és biológiailag lebomlanak.
Immobilizálására poliszacharidok leggyakrabban használt cellulóz, dextrán, agaróz és ezek származékai. Annak érdekében, hogy a kémiai stabilitás lineáris láncai cellulóz és dextrán keresztkötve epiklórhidrinnel. A kapott hálós szerkezetű bevezetett különböző ionos csoportokat. Kémiai módosítása keményítő térhálósító (formaldehid, glioxál, glutáraldehid) szintetizált új vivő - keményítő szivacs, miután fokozott ellenállás a glikozidázok.
Természetes aminosaharidov hordozóként használt kitin. A kitin kémiailag stabil, és jól definiált pórusszerkezet.
A proteinek közül hordozóként használt szerkezeti fehérjéket - keratin, fibroin, kollagén, és a zselatin (kollagén termék feldolgozás). Fehérjéket, amelyek képesek biológiai lebomlás, ami nagyon fontos a design az immobilizált enzimek orvosi célokra. A hátrányok mindkét fehérje hordozók ebben az esetben tartalmaznia kell a nagy immunogenitása.
Szintetikus polimer hordozók. A legtöbb szintetikus polimer hordozók mechanikai szilárdsággal, és annak lehetőségét, variációs széles határok pórusméret. Néhány szintetikus polimereket is elő lehet állítani különböző fizikai formákban (csövek, szálak, granulátumok). Ezek közé tartozik a polimerek, sztirol, akrilsav, polivinil-alkohol; poliamid és poliuretán polimerek.
Carriers szervetlen természetű. Mivel általánosan alkalmazott hordozó üveg anyagok, agyagok, kerámia, a grafit korom, szilícium-dioxid, és a silochrome fém-oxidok. Ezek lehetnek kitéve a kémiai módosítás, amely hordozóanyagokat filmmel bevont alumínium-oxid, titán, cirkónium, vagy kezelt szerves polimerek. A fő előnye, szervetlen hordozók - könnyű regeneráció. Mint a szintetikus polimerek, szervetlen hordozóanyagokat adható bármilyen formában, és azokat kapni bármilyen fokú porozitása.
Módszerek Az enzimek rögzítésére
Vannak két alapvetően különböző módszer enzim immobilizálása: fizikai (előfordulása nélkül közötti kovalens kötések az enzim és a hordozó) és kémiai (kovalens kötést közöttük) (7.2 ábra.).
7.2 ábra. Módszerek enzimek rögzítésére módszerek fizikai immobilizálás: egy - adszorpció; b - a felvétel a gél; in - beágyazás; g - a felvétel liposzómák; Kémiai immobilizáció módszerek: E - kovalens kötés
Fizikai módszerek immobilazatsii jelentése felvételét enzim egy olyan környezetben, amelyben a vele elérhető csak korlátozott része a teljes térfogat. A fizikai immobilizálás az enzim nem kötődik a hordozóhoz kovalens kötések. Négyféle kötődni enzimek.
Adszorpciója enzimek oldhatatlan hordozók. Adszorpciós volt az első eljárás enzim rögzítésére vált a legszélesebb körben használt Eljárás rögzített enzimek az iparban. A használt szilíciumdioxid adszorbensek, aktív szén, grafitos szén fekete, különböző agyagok, porózus üveg, poliszacharidok, szintetikus polimerek, alumínium-oxidok, titán és más fémek. Amikor adszorptív immobilizálását a fehérjemolekula megmarad a hordozó felületére elektrosztatikus, hidrofób, diszperziós kölcsönhatások és a hidrogén kötések. adszorpciós hatásfokot úgy határozzuk meg a fajlagos felülete (sűrűsége szorpciós helyek), és egy porózus hordozót.
Adszorpciója enzimek az oldhatatlan hordozó egyszerű és érjük el érintkezése egy vizes enzimoldatot egy hordozóval (statisztikai módszer, keverés közben, dinamikus módon, oszlopok). Erre a célra az enzim oldatot összekeverjük a friss iszapot, például a titán-hidroxid, és szárítjuk enyhe körülmények között. Az enzim aktivitása ebben a kiviteli alakban immobilizációs visszatartott közel 100%, és a specifikus fehérje koncentráció 64 mg per 1 g hordozót.
A hátrányok az adszorpciós eljárás közé tartozik az alacsony szilárdságú kötés az enzim egy hordozóhoz (változó feltételek deszorpció léphet Az enzim immobilizálása, annak elvesztése és a szennyeződés a reakció termékek). A kötés erőssége az enzim a hordozó javíthatja az előzetes módosítása média (feldolgozási fémionok polifunkciós szerek - polimerek, proteinek, hidrofób vegyületek, a lipidréteg, stb). Néha, módosítások molekula megy keresztül eredeti enzim, de gyakran vezet a aktivitásának csökkentését tartja.
Az enzimek rögzítésére való felvétellel gél. Az immobilizálás módjából enzimek által felvételét a háromdimenziós szerkezet a polimer gél elterjedt, mert az egyszerűség és egyediségét. A módszer alkalmazható nemcsak hogy mozdulatlanná egyes enzimek, de még multienzimnyh komplexek és az ép sejteket. Enzimek immobilizálásának a gélben hajtjuk végre két módon:
· Enzim vezetünk be a vizes monomer oldatot azután polimerizáljuk, amelynek eredményeként keletkezik a térszerkezete a polimer gél tartalmazza a cellában enzim molekulákat; poliakrilamid gélek, polivinil-alkohol, polivinil-pirrolidon, szilikagél;
· Enzim vezettünk be az oldatba a már kész polimert, amelyet ezt követően alakítjuk a gél állapotba; használva a keményítő gélek, agar-agar, karragenán, agaróz, kalcium-foszfát.
Az előnyök a enzimeknek gélek közé tartoznak:
· Egyenletes eloszlása az enzim egy térfogatú tápközegben;
· Magas mechanikai, kémiai, termikus és biológiai stabilitását a mátrix;
· Újrafelhasználhatósága enzim, tartalmazza a szerkezetét.
Az eljárás azonban nem alkalmas enzimek immobilizálására ható egy vízoldhatatlan szubsztrát.
Az enzimek rögzítésére a féligáteresztő szerkezet. Ennek lényege Az immobilizálás módjából - elválasztjuk a vizes oldat a vizes enzim-szubsztrát oldatot a féligáteresztő membránon keresztül permeábilis molekula kis molekulatömegű szubsztrátokat és kofaktorokat, de késlelteti a nagy enzim molekulákat.
A legszélesebb körben használt két változata ezt a módszert - a mikrokapszulázás és felvétele enzimek liposzómákba.
A mikrokapszulázás, hogy a vizes enzim-oldat tartalmazza a zárt mikrokapszulákat, amelynek falai vannak kialakítva egy félig-áteresztő polimer.
A méret a kapszulákat úgy állítjuk elő, több tucat vagy több száz mikrométer, és a membrán vastagsága - néhány század mikrométer.
A módszer előnye, mikrokapszulázás:
· Újrafelhasználhatósága a natív enzim (az enzim lehet elválasztjuk a nem reagált szubsztrát és a reakció termékek egyszerű szűrési eljárással);
· Az a lehetőség, hogy mozdulatlanná enzimek nemcsak az egyén, hanem a multi-komplexek, az egész sejteket sejtfragmentumokat.
A hátrányok az eljárás tartalmazza a képtelenség, hogy kapszulázott enzimeket elvégzésére az átalakítás a makromolekuláris szubsztrátok.
Inclusion vizes oldatainak enzimek liposzómákba. A liposzómák lipid oldatokat (általában lecitin) bepároljuk szerves oldószer. A visszamaradó vékony lipidfilmet diszpergáljuk vizes oldatban az enzimet tartalmazó. A folyamat során a önálló szerelési történik eloszlassa lipid kétrétegű szerkezetek tartalmazó liposzómák beépült enzimoldatot.
Az enzimeket immobilizálhatjuk beleértve a liposzóma szerkezete, elsősorban az orvosi és tudományos célra. A tanulmány a liposzómák nagy jelentősége van a megértéséhez minták a sejtek életének folyamatok, amennyire az enzimek a sejtben lokalizált a készítményben a lipid mátrixban a biológiai membránok.
Kémiai módszerek enzimek rögzítésére. Az enzimek rögzítésére képezve új között kovalens kötés az enzim és a hordozó - a legnagyobb tömegű módon besugárzással ipari biokatalizátorok.
Ellentétben a fizikai módszerek, ez a módszer egy erős immobilizációs és visszafordíthatatlan kötés az enzim hordozót, és gyakran kíséri stabilizálása az enzim-molekula. Az elrendezés azonban az enzim a hordozóhoz viszonyítva, a parttól egy kovalens kötés nehézségeket okoz a végrehajtása a katalitikus folyamatot. Az enzimet elkülönítjük a hordozó behelyezésével (térhálósító, spacer), mint ami gyakran jár difunkciós és polifunkciós szerek (bróm-cián, hidrazin, szulfuril-klorid, glutáraldehidet, és mások.).
Lényeges, hogy az enzim részt vesz az immobilizációs funkciós csoportok nem lényeges a katalitikus működéshez. Így, általában csatolt glikoproteinek keresztül szénhidrát vivőanyagot, nem pedig a fehérje része az enzim-molekula.
Minden kémiai immobilizációs eljárásokkal sorolják természetétől függően a reakció közeg csoport, reagál az enzim-molekula.
Az enzim immobilizálása a hordozóanyagok, amelyek gidroksogrupp. A leggyakoribb módszer alkotó között kovalens kötés az enzim és a hordozó, vagy szintetikus poliszacharid diol vegyület bromtcianovye módszer. A kezelés a hordozó brómciánnal reaktív imidokarbonaty cianátok és amelyek kölcsönhatásban nukleofil aminocsoportokat az enzim és a forma egy izokarbamid-származékok uretánok:
Az immobilizált enzimek a hordozó aminocsoportokat. Primer aminocsoportot hordozó társított egy aromás gyűrűt, a korábban alakítjuk a diazóniumsó, amelyet azután, hogy a különböző kapcsolási reakciók. A kapcsolási reakció jön fenolos, imidazol, amin, guanidin, tiolnte a fehérjék.
Immobilizálása hordozóanyagok, amelyek aktivált származékai a karboxil-csoport. Leggyakrabban a vegyületek acil-amino-csoportok a fehérje hordozó csoportok használt savanhidrideket, savhalogenideket, aktív észtereket és más karbonsav-származékok.
Immobilizálása hordozók immáron merkaptocsoportok. A szulfhidril-csoportok a hordozó és az enzim könnyen oxidálhatók diszulfidhidak kialakítására hatása alatt a levegő oxigén:
Előnyei kémiai immobilizáció - a nagy teljesítmény és kötés erőssége. Azonban a módszerek a kovalens kötéssel szemben nem állnak rendelkezésre az ipari felhasználásra összetettsége miatt, és költségessége azok alkalmazását.