Modern módszerek laboratóriumi diagnosztika herpes fertőzések
Kazmirchuk Vera Evstafievna, MD, egyetemi tanár, igazgató
Maltsev Dmitry Valerievich, PhD,
Igazgatóhelyettese Intézet Immunológiai és Allergológiai az Országos Orvostudományi Egyetem Bogomolets
1.Virusologichesky módszer. amelynek lényege, hogy elválassza a vírust fogékony sejttenyészetben (például fibroblasztok), vagy embrionált tyúktojásokban továbbra is a „arany standard” diagnózisához vírusfertőzések emberben, mivel a magas érzékenység (85-100%) és specificitása (100%), lehetővé teszi, hogy hogy tiszta a vírus tenyésztése további tanulmányozásra, különösen a vizsgálati antivirális érzékenységben. Ugyanakkor jelentős költségeit és bonyolultságát megakadályozza annak széles körű elterjedését a mindennapi klinikai gyakorlatban. virológiai technikával kapott eredmények túl későn (2-14 nap), hogy az ilyen diagnosztikai szükséghelyzetben (például vírusos agyvelőgyulladás vagy szepszis).
2.Electronic mikroszkópia feltárja vírusrészecskék a mintát, hogy meghatározzuk a faj a virionok által morfológiai jellemzőit, de ez a módszer malodostupen a klinikai gyakorlat és főleg a tudományos célokra.
3.Biologicheskaya minta áll megfertőzni érzékeny laboratóriumi állatokban (fehér egerek vagy nyulak) bioanyag betegből származik herpesz fertőzés; módszer használható vita esetén, herpeszvírus-fertőzés, például a diagnózis az atipikus herpeszes agyvelőgyulladás.
a) DNS hibridizációs - egy nagyon specifikus módszert azonosítani a vírus genom követően hibridizáló komplementer DNS-molekulák. A módszer a képességét méri, virális hibridizálódó DNS tanulmányozás alatt (specifikusan kötődnek) komplementer jelölt DNS-ismert eredetű, amellyel az a következtetés vonható fajok a minta azonosításához. A specificitás ezen módszer egyenesen arányos a hossza a komplementer polinukleotid láncok. Mivel a marker enzimek (például peroxidáz, alkalikus foszfatáz), vagy izotópok. Ezen kívül, kimutatására hibridizációs a jelenség az elektroforézis gélen, amely lehetővé teszi, hogy különbséget a elektroforetikus mobilitásának komplementer DNS-t és a komplex „komplementer DNS - DNS a vírus.”
b) polimeráz-láncreakció (PCR) - a legelterjedtebben használt módszer ma diagnosztizálására emberekben herpesz fertőzés, aki kínált Myullis 1983. A módszer alapja az enzim-katalizált DNS-polimeráz ismételt kialakulását a másolatok (amplifikáció) egy bizonyos DNS részét képviselő diagnosztikai fontosságú. Így az amplifikációhoz, azaz A DNS-szintézis templát, válassza ki a legkonzervatívabb része a virális genom, általában néhány egyedi gén, amely a legvilágosabban megkülönbözteti más kórokozók. A módszer lépései:
1) termikus elválasztása kettős szálú DNS-molekulák az egyes láncok (30-40 másodpercig 93-95 ° C-on);
2) lehűtjük a környezet;
3) bevezetése fajspecifikus primerek. azaz DNS-fragmenseket, komplementer nukleotid szekvenciák mindkét DNS-szál a teszt a kórokozó; A szintézis indításához a DNS-templáton két primer használatával, amelyek komplementer DNS-szál mindkét végén az adott fragmens;
4) bevezetése valamely termostabil DNS polimerázt, amely elindítja a szekunder példányban DNS-szálak;
5) újramelegítő;
6) hűtőközeg;
7) újra-bevezetésével primerek;
8) ismétlődő fűtési és hűtési eljárások;
9) után 30-80 ciklus felhalmozódása DNS másolatait azonosításuk végezzük elektroforézissel vagy immunfluoreszcens módszerrel [31].
Kölcsönhatás a primereket DNS-polimeráz és a DNS templát úgynevezett hőkezelési. mivel a reakció fordul elő 20-30 másodpercen át 50-65 C-on Ennek eredményeként dostraivaniya DNS-szálak egy adott fragmentum DNS-polimeráz által alkotott specifikus fragmenst - amplikon. Így, az amplikon magában lánc DNS templát, primer és a befejezetlen hozzá egy DNS polimeráz fragmenst a polinukleotid lánc. Mint már említettük, az első ciklus után meg kell ismételni, és szintetizált őket amplikonokhoz szolgálnak sablonokat későbbi szakaszaiban. Ebben az esetben úgy számítjuk, hogy a 30-40 ciklus egy tömb képes mintegy 10 augusztus amplikonokat (ábra. 1).
Ábra. 1. sematikus diagramja PCR stádium
Kiváló minőségű. szemi-kvantitatív és kvantitatív változatai a módszer. Ha kvalitatív PCR képes azonosítani a puszta tény, hogy a vírus jelenlétére, de lehetetlen felmérni annak reproduktív aktivitás, ami elfogadhatatlan a diagnózis herpesz, amelyben meg kell végeznie közötti differenciáldiagnosztikai látens, kitartó és reaktivált formák fertőzés. Félig kvantitatív PCR ad néhány információt a tartalmát a másolatok a virális DNS, amely kifejezett szimbólumok formájában (+, ++, +++, ++++), de ez a legtöbb célszerű elvégezni kvantitatív változata a módszer, amellyel lehetőség van arra, hogy pontos számszerű értékeket.
Meg kell érteni, hogy a mennyiségi kapott eredmény nem felel meg a valódi tartalmát kórokozó DNS-t a vizsgálati minta miatt amplifikálását a jelenség, amely a PCR során. Azonban még mindig van egy bizonyos arányosság összege közötti genetikai anyag a forrás és a végeredmény a vizsgálat, amely során csak abban az esetben diagnózis standard körülmények között ugyanazon reagenseket. Ezért az ilyen adatok felhasználhatók a klinikai diagnózis, ha elvégzi A beteg vizsgálata idővel, ugyanabban a laboratóriumban. Ha szükség van, hogy létrehozza a abszolút mennyiségét a virális DNS-t a mintát ezután végezzük normalizálására a kapott eredményeket (összehasonlítva bizonyos mennyiségű stabil termékek gén expresszióját ugyanaz különböző körülmények között).
PCR lehetővé teszi a fő hátránya a módszer a DNS hibridizáció, különösen ez jellemzi a magas érzékenység, mivel a mesterséges emelkedését tartalmát virális nukleinsav a vizsgálati anyagot. Is köszönhető, hogy ez a reakció mértékben felgyorsul, ha az eredmény.
PCR - egy nagyon pontos módszer; elméletileg elegendő ahhoz, hogy az eredmény, hogy egy közepes csak egy molekula DNS a kórokozó. A érzékenysége PCR 98% és specificitása - 94%. Álnegatív eredmények esetleges be nem tartását a technológiai eljárásoknak a vizsgálat, valamint az alacsony minőségű reagenseket. Téves pozitív adatokat lehet beszerezni az eredmények kiszámításánál az elektroforézis módszer, amely kapcsolatban van szennyeződése környezeti levegő munkaterület amplikonokat során kapott előzetes készítmények. Ezért az úgynevezett nyitott számítási módszert az eredmények igényel intenzív szellőztetésére. Sokkal jobb, hogy egy zárt számlálási technikák, mint például immunfluoreszcencia detektorok, ahol nincs közvetlen kapcsolat a reakciótermékek és a levegő közeg, és az eredményeket a tanulmány több helyes.
A legpontosabb módszer az ún nazyvaemoyreal timePTsR. azaz Real-time PCR-rel. A megkülönböztető jellemzője az a számítási összegét az amplifikált DNS-t, mint a felhalmozódása után az egyes amplifikációs ciklusban, ahelyett végén a termelés. Ez két módszert használ Felvétel eredmények: fluoreszcens „festék”. amelyek közvetlenül kölcsönhatásba lépnek cdvutsepochechnoy DNS és biztosítja annak ragyogás, és modifitsirovannyhDNK-oligonukleotid próbák (ábra. 2, 3). Az utóbbi tartalmaznak specifikus DNS-szekvenciák komplementer egyedi vizsgált gének kórokozó, valamint a fluorofor és a „kvencser” (kvencser), csatlakozott egy hordozó molekulához, úgynevezett egy riporter ( „vektor”). Fluorofor elszakadt a „abszorber”, és egy olyan lumineszcencia jelenség csak hibridizáció specifikus oligonukleotid-szekvenciák komplementer DNS-vizsgálat alatt.
Még kvantitatív PCR nem mindig megfelelően megkülönböztetni latetnye és reaktivált fertőzés, mivel ott van a jelenléte a vírus DNS mindkét esetben. Egy ilyen differenciáldiagnózis reverz transzkripciós PCR (reversetranscription PCR), amely lehet mennyiségének kiszámítására virális mRNS, ami azt jelzi, az intenzitása expresszióját a virális gének. A nagy mennyiségű mRNS-t a kórokozó jelzi újraaktiválása fertőzés.
1 - intakt próbát (fluorofor és a kvencser társított egymással); 2 - a mintát hibridizáljuk egy komplementer szállal a cél-DNS; 3 - hatása alatt a minta DNS-polimeráz megsemmisül, és megjelent Fluoreszkáló (fény hatása)
§ VE könyvek Kazmirchuk, DV Maltsev
„A klinika, diagnózis és kezelés herpeszvírus fertőzések emberben”