Laboratóriumi diagnosztikája rotavírus fertőzés szarvasmarha - studopediya
Rotavírus fertőzés (RVI), szarvasmarha (hasmenés, újszülött borjú) - ostroprotekayuschih fertőző betegsége, az újszülött borjak, azzal jellemezve, elváltozások a gyomor-bél traktus. A betegség széles körben elterjedt minden földrajzi régiók a világon. Gyakorlatilag újra bejegyzik, bárhol végzett kutatást. Bizonyított széles dissiminatsiya rotavírus (RV) borjak állatok különböző fajok és az antitestek jelenlétét a rágcsálókban (tengerimalac, patkány, hörcsög, egér).
Ennek alapján a járványos, klinikai és patológiai adatok, hogy előzetes diagnózis, csak az utolsó szett laboratornm módszerekkel. Az utolsó alapul vírus kimutatását vagy virális hipertónia betegeknél széklettel borjak, a tartalmát a bél, a nyálkahártya sejtek a vékonybél a elhullott és leölt állatok, valamint olyan antitesteket azonosítunk, hogy Pb szenvedő betegek szérumában, és helyreálljon a borjak és a szérum és a kolosztrum tehenek -materey.
Rapid diagnosztikai módszerek. Kidolgozott ELISA teszt-rendszer, amely a kimutatására a CM sertések adott RNC PB AG, amelynek nagy érzékenység és specificitás. A tanácsos használni a laboratóriumban a gyors diagnózis. Mivel VR5 polipeptid tartalmaz határokon Group AG-lokalizált Vanny egy konzervált domént, amely közös az összes az RV-csoport A. tűnt lehetséges indikáció forgatóberende- és koronavírus fluoreszcens próbák és antitestek hozzá. Ennek alapja a regisztrációs korai szakaszában vírus kölcsönhatás receptor-E sejtek.
Izolálása a vírus. A laboratóriumban legalább 10 folyadék közvetlen bélsárminta, a tartalmát a vékonybél (nem később, mint 2-3 óra után, a halál vagy levágása stimulált borjak), 10-15 minták és párosított szenvedő betegek szérumában megbetegedett gyomor-TION, a szérum mintákat 6-10 a vér a tehenek és 6-10 kolosztrum mintákat. A legnagyobb állandóságának vírus kimutatható a bélsár minták az első napon a betegség, így a következő, megfelelő széklet venni a 2-14 napos borjak klinikai tünetek a hasmenés, a 1-3 napos betegség. Közvetlenül a szülés után, hogy a laboratóriumi minták kezeltek vagy tároltak 4 ° C-on nem több, mint egy nap, át -20-50 ° C-on legfeljebb 1 hónapig. Szérum tároljuk 4-10 ° C-on maximum 1 hétig -20 ° C-on legfeljebb 1 hónap; A kolosztrum - 4 ° C-on legfeljebb 2 napon át -20 ° C-on - akár 1 hónap. A virológiai vagy elektronmikroszkópos vizsgálat készítünk 10% -os szuszpenziójának ürüléket a p-D Hanks. A szuszpenziót homogenizáljuk, és centrifugáljuk 1 órán át 3 ezer. Fordulat / perc, a felülúszót átvittük egy steril üveg, hozzáadott finom tsillin és sztreptomicin (1000 U / ml), és inkubáltuk 10-12 órán át (egy éjszakán át) 4 ° C-on és teszteltük.
Izolálása PB sejttenyészetben. A korreláció a betegség-novoro KIJELENTÉST borjú hasmenés jelenlétében hypertonia RV székletből. Meg kell jegyezni, hogy a szokásos kormányzati jelenti a vírus nem termesztik, és a használata járulékos hatások - Chi-dasági (tripszin) és fizikai (centrifugálás a vírus a sejt réteg) - előírja polo zhitelnye eredményez magas koncentrációban a vírus székletben, ami lehet ellenőrizni elektronikusan mikroszkópia. Erre a célra, a tartalmát egy cső fagyasztás és felengedtetés után és a kezelés polietilénglikollal újra felszuszpendáltuk 0,1 ml desztillált vízben, és megvizsgáltuk elektronmikroszkóppal. Pozitív esetben mutatnak Ti-pichnye részecskék PB és klaszterek. A sajátos jellege a részecskék megerősítette Meto-ház immun mikroszkóppal.
Amennyiben pozitív eredményt PB detektált részecskék készítményekben a Spec-idézésben koncentrációk (immunkomplexek). Értékelése sajátossága a reakciót számolva a száma és mérete a klaszterek, valamint a lefedettségi fokának egyedi virionok AT szérumot. Intenzitása ezt a hatást bizonyos képesség lehet értékelni skálán önkényes egységek 0-4 előnyöket.
IF. direkt és indirekt módszert sikeresen kimutatására alkalmazott vírus AG fagyasztott metszeteken a vékonybél, maz-kah széklet és a sejt kultúra. A vizsgálat-dovanii fagyasztott metszetek és bélrendszeri kenetet borjú széklet legjobb eredményeket 4-6 órán érzékelése után hasmenés jelei szempontjából. Az epiteliális sejtek gyorsan deskva-miruyutsya a felületről a bélbolyhok és eltávolítják a széklettel. Leggyakrabban a széklet szuszpenziót megfertőzi a sejttenyészet és vírusos azonosítani a magas vérnyomás, a re-akció IF. IF kifejlesztett egy közvetlen módszer a MDBK sejteket fertőztünk a táptalajjal vagy a széklet vírus eredetű anyag. A módszertani ajánlások PB katsii indium-RNC IF indirekt módszer előírja a használata egy diagnosztikai reagenskészlet, amely antigén-specifikus - susp vírust tartalmazó tenyészet Zia-PEC sejteket vagy MA-104; AH normál - nem fertőzött sejtszuszpenzió PEC vagy AI-104; specifikus savó kapott hiperimmunizálás borjak-labo-értékű állatok; normál szérum egészséges szarvasmarhák, nem tartalmazó antitestek PB; fajra elleni szérumot szarvasmarha globulinnal konjugált FITC (megjelent Ying-tute of Epidemiology és Mikrobiológiai. Gamaleya). NIF lehet használni kimutatására és azonosítására PB AG fertőzött sejttenyészetekben, ürülék és a Ki-shechnike beteg és halott borjak kimutatására és mennyiségi antitestek PB.
RDP. Ez - egy egyszerű és megfizethető módja kimutatására RV hipertónia betegeknél széklettel borjak, a tartalom a beleket és a bélnyálkahártya felfüggesztését stimulált vagy elhullott, idő-megölt borjú. Erre a célra egy 20% bélsár szuszpenzió foszfát-pufferolt sóoldat p újrameiegített vízfürdőben 37 ° C-on 30 percig, alkalmanként megkeverve. Ezután az ár-trifugiruyut 15 perc, 8000 g. A felülúszót átszűrjük egy „Millipore”, és a szűrletet bepároljuk, 25-szer alkalmazásával dialízis hub. Az eredmények, valamennyi feldolgozási lépés Tate 0,2 ml koncentrátum megfelel 1 g kiindulási anyagot Feka-ly. A forrás a specifikus antitestek konvaleszcens szérum után rotavírus gastroenteritis-TION, előre tesztelt más szerológiai tesztek.
RDP végezzük agarózgélen üveglemezen 0,9% agaróz egy pufferben p-D, 0,1M NaS1, 0,01 M trisz (hidroxi-metil) -amino-metán és 0,001 M etilendia-mintetraatsetata. Reakció komponensek kerültek a vágás az agaróz réteget lyuk dia-meter 3 mm, egymástól bizonyos távolságban 3 mm-rel. A lemezeket a gél állni egy éjszakán át szobahőmérsékleten, amely után figyelembe veszi az eredményeket. A lyukak közötti magas vérnyomásban és az AT a pozitív esetek, alakított világos vonal a csapadék. A RDP teszteljük AG - rész folyékony széklet vagy a felülúszóban centrifugálás után a szuszpenzió a széklet vagy a bél vizsgálat alatt származó szérumok lábadozók borjak molozi mennyiségét és a tej természetes formájában (például a szérum) kezelés után oltóenzim.
Immunprecipitáció reakciót kicsapódik megfestett fluoreszcens antitestekkel lehet alkalmazni dlyaobnaruzheniya ürülékében ember és PB PB borjú hasmenés. Kiterített Tang kifejezni annak módosítását. Diagnosticum tartalmazó normál és magas vérnyomású specifikus szérum leírt eljárással állítjuk elő VIEV, és a normál távú alkalmazása a szérum magzati szérum vagy szérum bezmolozivnyh borjak. Re-becsüljük a részesedése a csapadék képződése jellemző vonalak.
RSK. Azonosításához hipertenzió használják ritkábban, mint más módszerekkel. Ez kevésbé érzékeny, mint elektronmikroszkóppal és RIF, gyakran ad hamis pozitív eredmények az anti-sok bélsármintát. A kezelés azonban a széklet kiegészíti, magzati szérumot, freon, tisztítás ultracentrifugálással PEG 6000 vagy RAC nem rosszabb a elektronmikroszkópia érzékenység. A reakciót tesz mikromódszerével specifikus szérum vagy szérum nemrég beteg borjak szabadon antitestek más vírusok.
WIEF. Ebben a reakcióban, precipitációs vonalat között képződik a magas vérnyomás, a mozgó, az anód felé, és az AT, mozgó, hogy a katód. A minőség és a tisztaság a fő agaróz beállított facto reprodukálható eredményeket. A legtöbb kutató úgy véli, hogy ez a vizsgálat nem rosszabb, mint a elektronmikroszkóppal vagy meg is haladja azt.
VIEF javasolt a CM kimutatására székletből és patológiai anyagot és antitestek kimutatására a szérumban. Hogy tanulmányozza a felelős a folyékony trágya. Ha a folyadék része a tanulmány nem elegendő, a széklet mintákat centrifugáltuk 10-15 percen át 4-én. Rev / percig 4-10 ° C-on Vizsgáljuk meg a felülúszót. Intestine finoman porított, hozzáadunk azonos térfogatú fiziológiás R-ra, majd mozsárban homogenizálunk üveg, centrifugáljuk 2 percig 10-15 ezer. Rev / percig 4-10 ° C-on A felülúszót használjuk a reakcióban.
VIEF ad egy 0,85% p-edik újra agaróz előállított 0,5 mólos veronál-medinalovom pufferben (pH = 8,6).
ELISA. Érzékenység magasabb EI, IP, RSK, WIEF. Lehet használni, van a közvetlen és közvetett lehetőségeket, valamint felhúzása latex. ELISA lehet kimutatni a székletben PB borjak hígításban vizsgálati mintát 1: 5000. Opie-san szilárd fázisú ELISA-val a gépelési és osztály alcsoportokra PB emberi és hasa-CIÓ. Erre a célra az IgG 5 ug / ml; antisyvo hígítású nyúl-IgG ROTKO az RNC-től 1: 400. Az inkubáció időtartama, IgG -4 óra, a reakció PB AG IgG -3 óra, a reakció elleni antiszérum IgG komplex PB - PB AG -16 óra, egy olyan vegyület, a konjugátum - 4 óra, hogy változtatni a színét a hordozó (P-nitrofenil-foszfát) - 10 min. A vizsgálatok előtt-dovaniem borjak széklet hígítjuk 4-szer foszfátpufferes p-rum, tisztázta tsentrifu-girovaniem és elegyével kezeljük a Tween-20-nátrium-aziddal. Jelzések ELISA 100% egyetértésben az eredmények elektronmikroszkóppal.
A tesztrendszer alapuló ELISA RV kimutatására sertés egyedi RNC PB AG, amelynek nagy érzékenység és specificitás. Magyarországon kifejlesztett enzim immunoassay diagnosztikai kit gyártott VIEV. A készlet tartalmaz: egy adott liofilizált PB AG - vírust tartalmazó zagyot A tenyészetben kapott MA-104 sejtek, a koncentrált PEG 6000 és centrifugáltuk 6000g, szabályozására hipertenzió syvo liofilizáljuk rotavírus-specifikus ROTKO kapott hiperimmunizálás nyulak vagy borjak vírust tisztítjuk gradiens sűrűség rubídium-kloriddal; Száraz ból izolált immunoglobulinok Gypea rimmunnoy-rotavírus szérum kisózással telített p-rum (NH4) 2SO 4, majd ioncserélő kromatográfiás oszlopon DEAE-cellulóz.
Számos más módszerek azonosítására PB AG székletből borjak hasmenéssel :. Fordított passzív hemagglutinációs reakciót immunoagregatnoy GA eljárás, latex agglutináció, stb Így, a találmány tárgya egyszerű módszer kimutatására staphylococcus-TION PB ürülékében újszülött borjak használatával nyúlszérum azoknak PB-lyat. A módszer alapja az a felismerése a CM agglutináló aureus 10% díszíte-Sion székletmintáké a diákat Staphylococcus aureus, betöltve PB. Ellenőrző staphylococcus kezeltünk nem-immun nyúl szérum. Az agglutináció látható mikroszkóp alatt 2-3 perc után, miután a kör alakú lengő üveg. Annak elkerülése érdekében, a nem specifikus reakciókat hajtjuk előkezelés székletmintákat melegítéssel, szűréssel, és az N-acetil-cisztein. Az ilyen kezelés nem csökkenti a spe-tsifichnosti módszer. Összehasonlítva az ELISA-módszerrel szemben érzékenynek bizonyultak; az előnye-Tage az ő - a sebesség, az egyszerűség és az alacsony költségű, fontos szűrésére fájdalom Shogo száma bélsármintát.
latex agglutináció módszerrel végezzük kereskedelmi készlettel akkor Rotaleh-hatások RV székletből betegek specifikus, érzékeny, valamint eljárások az elekt-tron mikroszkópia, ELISA és IF. Hogy megkülönböztessük a alcsoportok és szerotípusai RV izolátumok leírt nukleinsav hibridizációs, elektroforézissel PAGE virion RNS-vírusok. Spot hibridizációs módszer igen specifikus, akkor képes felismerni 8 ng virális RNS és 10-100-szor érzékenyebb, mint az ELISA.
Variant azonosító segítségével monoklonális antitest. Kapott monoklonális ellenanyag darabokra. RIT4237 (szerotípus I) PB RNC. A semlegesítés AG kiderült változó specifikus a csoportok és alcsoportok meghatározói. Használata elleni Mab subgruppovyh AG ELISA alakult szeroprevalenciája II PB személyt mintákban ürülékében beteg gyermekek. A ilyen antitestek jelenléte növeli az érzékenységet és specifitását vizsgálati rendszerek.
Szerodiagnosztizálására és retrospektív diagnózis. Szerológiai vizsgálat vérszérum borjak nagyon korlátozott ár-ség. Az első hét az élet nem érzékeli AT növekedés ellenére az elmúlt betegség. A szint humorális antitestek a felnőtt állatokban nem teszi lehetővé prognosztizálása-esített előfordulása járványos betegségek az állományban.
RSK. Diagnosztizálására RVI mutatja a lehetőségét párosítva RSK-syvo Rothko volt beteg állatokat. Az első napokban KSA betegség a legtöbb állatoknál azok hiányát. By Day 7-10 szintje emelkedik, elérve a maximális nap 21, majd megy prois-csökkentés, valamint a 30-35 nap CSA titer eléri a nullát. RAC felvesznek-fel Todd mikro- és macrovolumes.
HAI. Tedd fel a szokásos eljárást használják virológiai diagnosztikai) cal laboratóriumokban. Alkalmazott és hagyományos üvegampullák vagy eldobható reagens térfogatát műanyag panelek lyukakkal és microvolumes reagensek. A post-Novki reakciót humán eritrociták csoportja O vörösvértestek, vagy tengerimalac. A teszt szérumot kezeljük a kaolin és a vörösvérsejt tömeg (az utóbbit - használata esetén humán eritrociták). Minden hígítást készítünk fiziológiás sóoldatban p-D kiegészített 0,04% albumin szérum RNC.
Közvetett IF, RN, radioimmunoassay által támasztott szokásos met-todikam.
Differenciál diagnózis. RVI újszülött borjak kell differenciálódás-ment koronavírus fertőzés colibacillosisos. Szükséges, hogy kizárja a dyspepsia az újszülött borjak táplálkozási eredetű. A vírus titrálása A csoport kidolgozott módszerek és dot blot RNS-hibridizációs próbák segítségével, hogy genomiális DNS-szegmens 4, amelyet PCR-amplifi giperdivergentnyh területeken VR4 fehérje gén (nukleotidok 211-686), hogy a DNS-darab. IR, IND, NCDV és Cr oligonukleotid primerek felhasználásával. 3 típusspecifikus próbák (VR4), és nem lép keresztreakcióba a 2-szálú RNS-heterológ RV R-típusok.