A alumínium mgu granzim családja a szerinproteázok családjától a limfocita granuláitól

Granzyme B, egy család a szerin-proteázok, fejezzük kizárólag citotoxikus T-limfociták és a normál ölősejtek (NK), komponensek az immunrendszer, hogy megvédje a magasabb organizmusok vírusos fertőzés és sejt-transzformáció. A granzyme-tartalmú sejt és a fertőzött vagy transzformált célsejt közötti receptor-mediált érintkezés után a granzimeket endocitózissal vezetik be a célsejtbe és apoptózist indukálnak. A Granzyme B az apoptózis leghatékonyabb induktora a granzimek családjától. A kaszpázokhoz hasonlóan a cisztein proteázok, amelyek fontos szerepet játszanak az apoptózisban, képesek a savakat, különösen az aszparaginsavat savas aminosavak mentén lebontani. Más granzimek további funkciókat is végezhetnek, és egyesek nem képesek apoptózist indukálni. A granzimeket csak emberekben és rágcsálókban tanulmányozzák, és szubsztrátspecifitással három alcsaládba lehet kombinálni:
- a kimotripszinhez hasonló enzimatikus aktivitással rendelkező granzimek, amelyeket "chimase locus" gének csoportja kódol;
- tripszin-szerű specificitású granzimek, amelyeket a "triptáz lokusz" kódol;
- és a harmadik alcsalád az el nem ágazó hidrofób maradékok, különösen a metionin után hasítódik, és a "Met-ase-locus" kódolja.
Minden granzimet proenzimként állítanak elő, és a vezető peptid hasítása és a dipeptid eltávolítása az N-terminálisból a maximális enzimatikus aktivitást érjük el. Mindegyiket blokkolhatják szerin-proteáz-inhibitorok, és a közelmúltban azonosították az inhibitorok egy új csoportját - a gerinceket, amelyek közül néhány a granzimekre specifikus. A gerincek jövőbeli vizsgálata egyértelművé teheti, hogy a granzimeket szintetizáló sejtek hogyan védve vannak az apoptózistól.

Génszervezet és evolúció

„Enzymes szemcsék”, vagy „granzimek” [1] alkotják körülbelül 90 tömeg% citolitikus granulátum (speciális „szekréciós” lizoszómák) citotoxikus T-limfociták (CTL-ek) és a normál ölősejtek (NK). Granzimek szerkezetileg rokon kimotripszin, triád kulcsfontosságú aminosavakat - hisztidin, aszparaginsav és szerin a katalitikus centrumban és a genetikailag kapcsolódik más szerin proteázok leukociták, különösen a monociták és a hízósejtek. Mind a nyolc granzimek (A-G és M) azonosítottak egerekben, de csak öt személy által ismert (A, B, H, M és triptáz-2 néven is ismert granzyme 3). Emberekben az egér C-G grangin-ekvivalensek ismeretlenek, és a granzyme H csak az emberre jellemző (1. táblázat).
Minden granzimek gének rendezett hasonló módon, és azok transzkriptumok képződnek öt exont, az első a kódoló vezérszekvenciát, mivel exonokat 2, 3 és 5 kódolnak egyes aminosavakat a katalitikus triád (1. ábra). Bár a legtöbb granzyme-gén csak egy transzkriptumot kódol, a granzyme A két mRNS-ja különböző exonok alternatív összekapcsolódásának eredménye.
A géntervezéssel kapcsolatos vizsgálatok azt mutatják, hogy három granzim humán és egér alcsaládot korreláltunk három megfelelő helyszínnel, mindegyik alcsaládnak saját, széles szubsztrát-specifitása volt (2. táblázat). A patkánygének leképezésének eredményei még nem állnak rendelkezésre. Az emberi granzyme A-t (HFSP) és a triptoza-2-t (TRYP2) kódoló géneket az 5q11-q12 kromoszómára térképeztük fel [2]. Granzyme B és H gének leképezve a klaszter a szerin proteázok a 14q11, amely tartalmaz egy gént proteáz katepszin G, amely specifikus a mieloid sejtek [3]. A Granzyme M gén az azurokidint (AZU), a neutrofil (NE) elasztázot és a proteináz-3-at (PR3) kódoló gének mellett helyezkedik el a 19p13.3 kromoszómán [2,4]. Az egér, illetve - a 10. kromoszómán granzyme A és egyéb triptáz, 14D (granzimek B-F) és 10C (granzyme M, AZU és NE).
Általában, alcsalád granzimek rendre (2. táblázat) tripszin-szerű, kimotripszin-szerű és elasztáz-szerű specifitással és azok génjeivel vannak csoportosítva loci „triptáz,” „kimáz” és a „Met-áz” [4]. Ezek a géncsoportok bizonyos sajátosságokat mutatnak. Például, az egér és a humán gének granzyme M, AZU PR3 és mindegyikhez intron 1-gyök között helyezkedik -6 és -7 vezető szekvenciát, jelezve a közeli evolúciós kapcsolatot. Emberekben, a kódoló gének granzimek B és H és a katepszin G-szorosan összefügg, belül helyezkedik el 50 kb távolságra vannak egymástól. A granzyme-H-gén között található két másik gén, és esetlegesen kialakult egy „hibrid”, az első három exon és intron granzyme-B-gén, és a másik végrésze a szerin proteáz gén. A hibrid megjelenését pontmutációk felhalmozódásával lehet elérni.
Egér, patkány és humán B granzimek tartalmaznak körülbelül 70% -ban azonos aminosavak, míg a granzimek bármelyikén belül az alcsalád (például granzimek B és C az egér) hasonlóak a 55-70%. Hasonlósága aminosavszekvenciák csökken mintegy 30-40%, ha összehasonlítjuk a különböző alcsaládot granzimek, mint például a granzyme A és granzyme B (37%), még egyazon fajba. Bár a granzimeket valószínűleg különböző fajokban találják meg, amelyek fejlett immunrendszerrel rendelkeznek (például madarakban), ma sajnos a granzimek szekvenciáját csak emlősökben határozzák meg.

Mint más szerin proteázok, a katalitikus aktivitást meghatározzuk granzimek szerin maradékot az aktív központban, egy triád csoportok His57, Asp102, és Ser195 a kimotripszin [4]. Vannak oxidációs zsebük is az enzim-szubsztrát komplex közbenső állapotainak stabilizálásához és egy szubsztrátkötő zsebhez, amelynek alakja meghatározza a proteáz specifitását. Nemrégiben meghatároztam a patkány granzyme B kristályos szerkezetét [5]. A kristályszerkezet számos meglepetést mutatott. Kimutattuk, hogy a granzyme B szubsztrát rése meglehetősen tág, és itt akár nyolc szubsztrátum maradvány is található. A P1 szubsztrát-maradékkal való érintkezésben lévő kulcsmaradék (az aminosav, amely az elválasztható kötés közelében található N-terminális irányban, általában aszparaginsav) Arg226 (2. ábra).
A granzimeket proenzimként szintetizálják, amely a csomagolás során érlelődik a citolitikus granulátumokká. Hasítása után a vezető peptid két aminosav, kapcsolódik az érett aminosav-szekvencia van, amely később vágott dipeptidilpeptidáz I (DPPI, más néven katepszin C), peptidáz konstitutíven expresszálódik a lizoszómákban [6]. A granzimek csak az aminoterminális dipeptid lehasítása után katalitikusan aktívak; pH optimális értékét körülbelül 7,5 és granzimek, így maximálisan aktív, amikor felszabadul a szekréciós granulumok a citoplazmában (pH-érték 7). DPPI - kulcsfontosságú szabályozója granzimek funkciók és DPPI-hiányos egerek granzimek aktivitás alacsony vagy nem létező. Az éretlen granzimek expressziója a DPPI-t nem tartalmazó sejtekben egy inaktív granzimfehérje képződését eredményezi. Az ilyen sejtekben a granzimek expresszálódhatnak, ha az aktiváló dipeptidet eltávolítják.
Az A és B granzimek mannóz-6-foszfát molekulákkal vannak ellátva mannóz-6-foszfátreceptor [7] csomagolására, ugyanez a granzimek, az emberek és a rágcsálók. A granzimek kisebb részét mannóz-6-foszfát-független módon csomagolják. A granzimek szintén nem konstans N-terminális glikozilezésen mennek keresztül. Az egér granzyme C számos glikozilezett maradékot tartalmaz, míg egy másik esetben a granzyme D molekulatömegének fele öt pontban tartalmaz szénhidrátot. A granzimek hasonlóak a kimotripszinhez hasonló enzimekhez, de vannak bizonyos jellemzőik. Az 1-4. Pozíciókban (általában Ile-Ile-Gly-Gly) és 9-16-ban lévő maradékok nagymértékben konzerválódnak minden granzimben, mind emberben, mind rágcsálókban. Dipeptid szekvenciájuk általában Gly-Glu vagy Glu-Glu. Három konzervatív diszulfidkötés van, bár az A és az M és a tripta-táz-2 jelölőnégyzete négy. Granzyme A az egyetlen granzim, amely dimer az intermolekuláris diszulfid hidak miatt.

Lokalizálás és funkció

A kifejezés a granzimek korlátozott az aktivált T-limfociták, éretlen T-sejtek a csecsemőmirigyben (timociták), egy kis populáció speciális T kletkok elsősorban kimutatható a bélben és a normál killer. Ezek, az NK-sejtek és T-sejtek a bél folyamatosan termelődik és felhalmozódik granzimek, míg a T-limfociták termelnek mRNS és fehérje láncokat granzimek kell által indukált kitettség egy antigénnel vagy más típusú stimuláció. A granzimeket a CD8 + többsége és a CD4 + T sejtek kisebb része expresszálja in vitro antigénnel vagy lektinekkel [8]. A granzyme M gént csak NK sejtekben fejezzük ki, míg a Met-ase lokusz által kódolt alcsalád többi granzimje sokkal gyakoribb.
A granzimeket a DPPI végső feldolgozásának vetjük alá, amikor citotoxikus granulátumokba csomagoljuk és aktív enzimként tároljuk, amely a célsejtekkel való érintkezés után készen áll a beadásra. A granulák két zónát mutatnak ultrastrukturális kutatások alatt. Mindegyiknek sűrű központi magja van, amely granzimeket, perforin toxin granulátumokat és savas proteoglikán-kondroitin-szulfátot (CS) tartalmaz. A nettó negatív CS töltés megkönnyíti a granzimekhez való kapcsolódást, amelyek alapjai és pozitív töltései a granulátum pH-ján. Az egyes granulák külső zónája tipikusabb szerkezetű a közös lizoszómához. A granulátumok véletlenszerűen eloszlanak a citoplazmában, de gyorsan kapcsolódnak a kontakthelyhez a célsejtekkel érintkezéskor, amikor a vegyület előfordul, egy polarizációnak nevezett eljárásban.

A granzyme B apototikus funkciója

A granzimek fő funkciója a fertőzött vírus és más potenciálisan veszélyes sejtek halálának indukálása. Ezzel elérik ezt a kulcsfontosságú szubsztrátokat a célsejtekben egy perforinfüggő útvonalon keresztül. Perforin-hiányos egerekben az abszolút hiba a minden granzyme-közvetített sejthalál utak, és az indukciós és érzékenyek a különböző vírusok és egyéb intracelluláris patogének, mint például a Listeria monocytogenes [9]. A Granzyme B a legmagasabb apoptotikus aktivitással rendelkezik az összes granzimből, mivel kaszpáz-szerű képességük van a szubsztrátok lebontására az aszparaginsav kulcsmaradványain. De a granzyme B-nek hiányos egereknek sokkal enyhébb immunhiányuk van, mint a perforin-defecitikus egerek; Feltételezhető, hogy funkcionális redundancia van a granzyme által indukált apoptózisban. In vitro körülmények között a B-hiányos egerek granzyme-CTL -ei stimulálják a DNS-fragmentációt a célsejtekben sokkal lassabban, mint az egerek vad típusú CTL-jei [10]. Az egyéb granzimek szignifikánsan gyengébb apoptózisú aktivitást mutatnak, amit legjobban a granzyme A, triptáz jelenít meg, ami fokozhatja a granzyme-B által közvetített sejtpusztulást. Granzyme A serkentik kaszpáz-aktiválás sokkal kevésbé hatékony, mint a granzyme B, de más a apoptotikus hatása miatt, hogy képes hasítani szubsztrátok a kaszpázok.
Az a képesség, granzyme B sejthalált indukálni az utóbbi években részletesen tanulmányozták. Granzyme B képes hasítani, és így aktiválja több procaspases közvetlenül is lehet, hogy lebontják néhány kaszpáz szubsztrátok, beleértve egy inhibitora kaszpáz-aktiválás DNáz (ICAD). Ez elsősorban a DNS szétdarabolódását érinti a célsejtben. Túlexpressziója antiapoptotikus protein Bci-2 a mitokondriumban teljesen gátolta granzyme B, ami azt jelzi, hogy a megsemmisítése a mitokondriumok szükséges része granzyme-közvetített sejthalál [11]. Nemrég kimutatták, hogy a humán és egér sejtek tagja proapoptotikus család Bcl-2 Bid gyorsan specifikusan hasítja granzyme B disztálisan helyzetű aszparaginsav 75, és a rövidített molekulát Bid helyezünk a mitokondriális membrán, hogy indukálja az proapoptotikus mediátorok, beleértve a citokróm c és Smac / Diablo [12]. Emellett kaszpáz-függő mechanizmusok állnak rendelkezésre, és a kaszpáz-független utak: a sejtekben, amelyekben kaszpázaktivitások fennáll, azonban elpusztult granzimek. Bár kaszpáz-független mechanizmusok még nem teljesen ismertek, de valószínűleg ők hajtják végre a pusztítás a citoszkeleton.

A granitumok nem apototikus funkciói

Granzimek felfedezték számos további funkciók, különösen a tripszin-szerű granzyme A, amely részt vehet a osztódásának szabályozásában a B-limfociták. Tisztított egér granzyme Egy lehet mitogén hatást gyakorolnak a B-sejteket antigén nélkül, és jobban hasonlít más „triptáz”, mint például a trombin és a tripszin. A Granzyme A számos extracelluláris mátrixfehérjét oszthat meg, és ezáltal elősegítheti a T és NK sejtek szövetekben való migrációját. A granzimek indukálják a citokinek szekrécióját, közvetlenül aktiválják bizonyos citokineket, és így fokozzák bizonyos típusú gyulladásokat. Granzyme Egy képes hasítani a trombin receptor után szekvencia Leu-Asp-Pro-Arg, hogy indukálja az interleukin IL-6 és IL-8 a monociták és a neurit-oligodendrocitákban. Szerepe granzimek A és B közvetlen ellenőrzése a vírusfertőzés találtak egerek célzott megszakítására gének granzimek A és B, kapott egerekben kimutatták kifejezett érzékenységet fertőzés citopatikus Ortopoxvírus, ectromeliája. Ennek ellenére, granzyme A-hiányos egerek képesek rendesen válaszolni, hogy a nem citopátiás koriomeningi vírus (LCMV), valamint egy intracelluláris bakteriális patogén Listeria monocytogenes, és megszünteti néhány a szingenikus tumor sebességgel tipikus hagyományos állatok.

A szubsztrát-specifitás és a granzyme-inhibitorok

Granzyme B van egy nagyon magas szubsztrát specifitás, összhangban szerepük több feldolgozási, mint a lebontó enzimeket. Emésztési proteázok, például a tripszin, kimotripszin és elasztáz, van egy nagyon széles körű szubsztrátok és aminosav környezet P1 szubsztrátum maradék nem olyan fontos, mint hogy a granzimek, amelyben több, mint 5 maradékok szomszédos P1 helyzetben befolyásolhatja a felismerési és hasítási. Szubsztrát specificitás teljesen megadott granzimek A és D, valamint triptáz-2 (mindegyik a triptáz és gyakran jellemzi, hogy képesek hasítani Na-CBZ-L-lizin tiobenzilovy-éter) a granzyme B ( „Asp-áz”, hasítás aszparaginsav sav és esetleg glutaminsav), granzyme M (más néven „Met-áz” és hasítását a metionin) és granzyme H (kimáz). A granzyme B egy szerin-proteáz, amely jellemző csak emlősök, amely hat a-oldallánc [14], szükség van, a funkció végrehajtásához proapoptotikus enzim hasítási Bid és prokaszpáz.
Különböző szintetikus vegyületek, beleértve a peptid-tiobenzilovy-éter, 7-amino-4-metil-kumarin és származékai paranitroanilida (pNA) vizsgáltunk, hogy meghatározzuk az optimális szubsztrátum és hasítási feltételek granzimek. Legjobb paranitroanilidnymi szubsztrátok D-Pro-Phe-Arg-pNA az egér granzyme A és tozil-Gly-Pro-Arg-pNA granzyme Egy személy. Mindkét Granzyme A inaktiváljuk szerin-proteázok inhibitorai, mint például a diizopropilflyuorofosfat, fenilmetilsulfonilflyuorid, bezamidin, aprotinin, leupeptin és szójabab tripszin inhibitor. Továbbá, mindkét típusú granzimek Egy lehet blokkolni számos fiziológiai inhibitorok, mint például? 2-makroglobulin, az antitrombin III és C1-észteráz-inhibitor, amely képes megvédeni a környező szövetet a károsodás miatt kedvezőtlen degranulációt [15]. Számos granzyme A inhibitor csak kis mértékben gátolja a granzyme B-t. Az egyik nagy tanulmány bizonyult a legjobb inhibitor a humán inhibitor? 1-proteáz, amely a csökkenését okozza granzyme B aktivitását 85%, amikor felhasználást dózisban 10 mg / ml [14].

Biológiai jelentőségük ellenére a granzimek viszonylag kevéssé ismertek, és számos fontos kérdés vár választ. Természet közötti szinergiák perforin és granzyme - a mechanizmus, amellyel granzimek esik endoszómákon hatolni a megcélzott sejt még nem egyértelmű. A kaszpáz-független utak sejthalál fontos, mert lehetővé teszik a CTL-ek, hogy elpusztítsa a sejteket, hogy a zárolt virális kaszpáz inhibitorok, mint például a citokin-válasz módosítóval A (crmA), szintetizált poxvirides. Ismét ezen útvonalak természetét még nem magyarázzák meg. Granzyme B de A és B, természetesen szintén van egy csomó funkciók, amelyek nem kapcsolódnak az apoptózis és a tanulmány hiányos egerek egy bizonyos gén granzimek kell megvilágítani a kutatás területén. Érdekes többet megtudni a gránit funkciók szabályozásáról új serpinek segítségével. Ezek a vizsgálatok nagyon fontos lehet az elképzeléseink a immun-homeosztázis (pl szabályozása CTL válaszul fertőzés), és a válasz vírusfertőzés és a rák.