A génállomány megőrzésének biotechnológiai módszerei - krioprezerváció, krioprezerváció, növekedési retardáció
Módszerek a génállomány megőrzésére
A kriokonzerválási módszer, a növekedés lelassulásának módszerei
Hasznos tulajdonságokkal rendelkező sejtvonalak beszerzése során felmerül a probléma, hogy ezeket a tulajdonságokat megőrizzük. A növények képesek genetikai információt tárolni a vetőmagokban, de ez a forrás nem teljesen megbízható, mert a mutációk miatt idővel a magok csírázása esik. Ezenkívül egyes növények csak vegetatív módon szaporodnak. Ez megköveteli az anyag egy részének in vitro megőrzését. Másrészről azonban egyes esetekben új sejtvonalakat lehet beszerezni, amelyek másodlagos metabolitokat termelnek, vagyis termelékenyebbek, amelyeket meg kell őrizni.
A szövetekben lejátszódó fiziológiai és biokémiai folyamatok tanulmányozásához szabványos kezdeti tenyészetek is szükségesek, ami szükségessé teszi az anyag bizonyos ideig történő megőrzését, amikor soros kísérletek folynak. Mindez rendkívül sürgetővé teszi a génállomány megőrzésének problémáját.
Természetesen lehetséges passziválni és átültetni a sejttenyészeteket. Ugyanakkor fennáll a somaklonális változékonyság, a mutációk felhalmozódása, a szennyeződés (idegen genetikai anyagokkal való szennyezés). Ezenkívül bizonyos pénzügyi és munkaerőköltségeket is igényel (gyakori transzplantációk, a környezethez kapcsolódó költségek stb.). A kutatók célja a transzplantációk közötti intervallum növelése. A növények megőrzéséhez különböző megközelítések vannak:
- szárítás (spray és liofil) - mikroorganizmusok sejtjeihez.
Cryopreservation - fagyasztás ultra-alacsony hőmérsékleten. Általában folyékony nitrogénben, -196 ° C hőmérsékleten hajtjuk végre.
Az alacsony hőmérsékletű megőrzés sikere számos tényezőtől függ:
- a sejtek típusa és típusa,
- koncentrációjuk a szuszpenzióban,
- a konzervkörnyezet összetétele,
- a krioprotektáns típusát és koncentrációját,
- hűtés és fűtés üzemmód,
- a sejtek rehabilitációját a fűtést követően.
Jelentős szerepet a sikeres befagyasztása sejtek játszik azok morphophysiological állapot: sejtek a stacioner növekedési szakaszban, kevésbé ellenálló a károsító hatását az alacsony hőmérsékletű megőrzése, mint a sejtek az exponenciális növekedési fázisban. A fagyasztási sejteket a növekedési görbe exponenciális fázisának közepén vettük fel.
Ugyanilyen fontos a fagyasztott felfüggesztés sűrűsége. A sejtjavításra optimális eredményeket kaptunk egy sejtszuszpenzió fagyasztásával 1 × 10-5-510 sejt / ml sűrűséggel.
A növényi sejtek esetében gyakran előkezelésre van szükség különleges körülmények között. Különféle anyagokat adunk a táptalajhoz, például:- 2-6% mannit vagy szorbit a vacuolák méretének csökkentésére;
- aminosavat, elsősorban prolint, amely a sejtben lévő víz kötését szolgálja (koncentráció 1 mólig vagy 11,5% -ig), aszparagin, # 947; -amino-vajsav;
- dimetil-szulfoxidot (DMSO) tartalmaz, amelyet 48 óráig 2,5-10% -os koncentrációban adunk a prekurzális tápközeghez a citoplazmatikus membrán permeabilitásának növelése céljából;
- Továbbá alkalmazni mesterséges keményedés a hideg, amikor az alsó tenyészet hőmérsékletét, szimuláló természetes csökkenése az előállítási eljárás a téli nyugalmi időszakban (csak azokra a mérsékelt éghajlaton a növények). Sejttenyészetek tartjuk néhány napig hőmérsékleten 8-10 ° C, majd a 2-5 ° C-on 1 - 6 hét.
Az állatokból származó növényi sejtek fagyasztásának folyamata főleg egy előtenyésztési lépés jelenlétével jellemezhető.
A krioprotektánsok olyan anyagok, amelyek csökkentik a fizikai-kémiai tényezők káros hatását a krioprezervációban. Ezek közé tartozik a szacharóz, dextrán, etilénglikol, polivinil-pirrolidon, dimetil-szulfoxid (DMSO), glicerin. A krioprotektáns toxicitásának meghatározásához a sejteket különböző koncentrációkban 30-50 percig szobahőmérsékleten tartják, majd életképességüket meghatározzák. Ezenkívül védő tulajdonságait a tenyészetek próbafagyasztásával és felolvasztásával értékeljük. A leggyakrabban alkalmazott krioprotektánsok a glicerin és a DMSO. A krioprotektáns hozzáadása előtt a sejtszuszpenziót centrifugálással koncentráljuk, a felülúszót leöblítjük. A krioprotektort a fagyasztás előtt egy órával vezetik be a tenyészetbe, ami a membrán permeabilitásának megváltozásához, a fagyáspont megváltozásához és a felolvasztáshoz vezet.
A hűtési programok eltérőek lehetnek, de mindegyiket lassú hűtési sebesség jellemzi. Fagyás közben a sejtek belsejében és azon kívül jég alakul ki. Ezeknek a változásoknak a jellege a vizsgált mintától és a fagyásgátló kezeléstől függ, főleg a hűtési sebességtől függ. Lassú hűtés esetén az extracelluláris jég keletkezik, ami a sejtek dehidratálódásához vezet, mielőtt elérné a citoplazma fagyáspontját. Gyors hűtéssel a sejtek gyorsan befagynak belülről, lassabban dehidrálódnak, ami a sejten belüli jégkristályok képződéséhez vezet. Ebben az esetben a sejtek sérültek. A hűtést általában két lépésben végzik el (26. ábra):
Ábra. 26. A sejtfagyasztás: a) gyors, b) lassú, lépésenként
Stage 1: +20 és -28 ° C sebességgel 1 fok per perc (0,5 fok fagyasztás növényi sejtek percenkénti -35 ° C), ezen a hőmérsékleten tartjuk 15 percig.
A második szakasz: folyékony nitrogénbe merítés (pillanatnyi hűtés -196 ° C).
A fagyasztás speciális berendezéssel történik. Ezek hiányában - alkohol fürdőben (0,5 - 1 liter alkoholt öntünk a fém termosz lombikot elmerül benne 15 percig ampullák és hozzáadjuk, keverés közben folyékony nitrogén vagy szárazjég, a hőmérsékletet -32 ° C (a hőmérséklet kell lennie legfeljebb -28 és nem lehet alacsonyabb -32 ° C-nál). A további ampullákat folyékony nitrogénre visszük át.
Amikor a felolvasztás ampullák csipesszel át vízfürdőn 37-40 ° C-on, az ampullát térfogata 1 ml felolvasztott számára 0,5-1 perces.
Felolvasztás után a sejteket vagy tápközegben (állatok) vagy hordozóközegben mossák. A vegetatív sejteket szintén 3-10% szacharózoldattal lehet mosni.
Ezután a sejteket életképes festékekkel ellenőrizzük, élethű festékek segítségével. Az utolsó kritérium a növekedés világos újraindulása az adott kultúrában alkalmazott tápanyag-tápközegek esetében.
Az állati sejtek felengedését követő átültetett tenyészetének fokozott érzékenysége van a vírusokkal szemben, ami az első két szakaszban manifesztálódik. Ezután az érzékenység visszatér az eredetihez.
A lassú növekedés a következő módszerekkel érhető el:
1. Tárolás ásványi olaj réteg alatt (bakteriális és gomba kultúrák esetén).
2. A gázösszetétel és a légköri nyomás változása a tenyésztőedényben.
3. Módosítsa a fény módot.
4. Hűtsük az aktív növekedés megszüntetésének hőmérsékletére.
5. Hormonális és ozmotikus inhibitorok alkalmazása. A hormonális gátlók közül kloro-kolin-kloridot alkalmaznak leggyakrabban (növényi sejtek esetén), ozmotikus mannitol 3-6% koncentrációban.
6. CaCl2 helyettesítése Ca (NO3) 2 tápközegben.
A burgonya mint olyan módszer, amely lehetővé teszi a génállomány megőrzését, a tubusképződés a kémcsövekben ajánlott.
A fejezet egyéb fejezetei: