A tiszta tenyészet izolálása külön kolóniából
A mikroorganizmusok tiszta tenyészeteinek izolálásának fő módszere R. Koch által javasolt módszer. Elve az, hogy egy tiszta kultúrát egy külön gyarmatból szerezzenek be. Ez a módszer azonban nem alkalmazható olyan mikroorganizmusok izolálására, amelyek nem sűrű táptalajon nőnek vagy gyengén fejlődnek. Ilyen mikroorganizmusok közé tartozik néhány baktérium, sok alga és protozoa.
Ábra. 6.2. A mikroorganizmusok vetési kultúrája
egy sűrű közeg felületén spatulával:
a - Drigalsky spatula; б - szitálás; növekedést
mikroorganizmusok szitálás után
Amikor az aerob mikroorganizmusok tiszta tenyészete izolálódik, a tárolási tenyészetet sűrű közeg felületére vetik. Az eljárás a következő. Egy steril Petri-csészékbe öntött, forró vízfürdőben megolvadt, és 50 ° C-ra hűtött tápközegbe hűtött, agar vagy zselatin. Miután a keret megszilárdul felületén alkalmazzák egy pipettával csepp szakaszos tenyésztés vagy hígított steril víz és sósav-steril Drigalski spatulával üveg megosztjuk csepp felületén lévő szilárd közeg egy Petri-csészébe. Továbbá ugyanazzal a spatulával a tápközeg felülete a második, harmadik és negyedik csészében egymást követően törlődik. Általában az első két csészében az inkubálás után folyamatosan növekszik a mikroorganizmusok száma, míg az elkülönített telepek kétszeres növekedése (6.2. Ábra). A felhalmozódó kultúra terjesztése bakteriológiai hurok segítségével történik a kimerítő stroke módszerrel. Ebben az esetben a tárolási kultúrát vagy annak hígítását egy hurok és egy sűrű közeg felülete választja ki, a vonalakat a 2. ábrán jelzett sorrendben húzzuk. 6.3. Minden új ütem előtt a hurok sterilizálódik az égő lángjában.
Beoltás után Petri-csészéket inkubátorba helyezzük kiterjed le a kondenzációs víz képződik a borító lapokat a megszilárdulása az agar megakadályozta nem izolált telepeket kapjunk. A lemezeket inkubáltuk 1 -7 nap függően a növekedési ráta mikroorga-nisms. Advancing izolált telepeket átvizsgáljuk hurok a kúpos felületét a sűrű közegben in vitro vagy folyékony közegben.
A mély vetés módja. A mikroaerofil mikroorganizmusok izolált telepeit és a fakultatív anaerobokat gyakran mélyebb vetéssel nyerik. Ehhez sűrű táptalajt előzetesen 15-20 ml-es csövekbe öntünk és sterilizáljuk. Közvetlenül vetés előtt a pro-címkéket forró vízfürdőbe helyezzük, hogy a közeg megolvadjon. A vetést a tárolási kultúra hígításaiból steril csapvízben végezzük. A hígításokat oly módon készítik el, hogy 0,5-1,0 ml hígítás után vetett kolóniákat kapjanak. Meghatározzuk a hígítás mértékét
a kumulatív tenyészet sűrűsége. A vetés végső soron hároméves,
az utolsó négy hígítást. Erre a célra 0,5-1,0 ml, a replikált tenyészet egyikének hígítását beviszik egy kémcsőbe, amelynek olvasztott tápközege 48-50 ° C-ra hűl. Vetés ma
Az anyagot alaposan összekeverjük, a csövet a tenyér között forgatjuk.
Ábra. 6.3. Szekvencia diagram (7 - 5)
A mikroorganizmusok vetési kultúrája egy sűrű közeg felületén egy hurkon keresztül
körül az égő lángja ezután eltávolítjuk a cső dugót, a szélén égő egy lángcső az égő, és a cső tartalmát gyorsan öntjük steril Petri-csészébe. Miután megszilárdult az agarizált tápközeg, a Petri-edényeket termosztátba helyeztük. A közepes vastagságban termesztett kolóniákat steril szikével kivágjuk, steril kapilláriscsövekkel vagy egyszerűen hurokkal extraháljuk, és a felszabadított mikroorganizmusok kifejlesztésére alkalmas folyékony közegbe visszük.
Különleges nehézségek merülnek fel a kötelező anaerob tiszta kultúrák elkülönítésében. Ha a molekuláris oxigénnel való érintkezés nem okoz azonnal halálesetet, akkor a tenyésztést a táptalaj felületén Petri-csészékben végezzük, de a vetés után a csészéket azonnal anaerosztátba helyezzük. Azonban a tenyésztési módszert gyakran használják. Lényege abban rejlik, hogy a tárolási kultúra hígítását az olvadt és lehűtött 45-50 ° C-os agar tápközegben végezzük. Adjon 6-10 egymást követő hígítást. Ezután a közeget a csövekben gyorsan lehűtjük és vízbe ste-réteg felületére-steril paraffin és vazelin olajat (az arány 3: 1), amely ellene hat a pre-levegő behatolását a belső az agar tápközegben.
Néha az agarizált táptalaj, a vetés után és alapos keverés után steril Burri csövekbe kerül. Lehetőség van Pasteur kapilláris pékáru felhasználására, amelyekben a tárolt tenyészet megfelelő hígítása felgyülemlik az olvadt agar tápközegben. A kapilláris végét lezárják. A tárolási kultúra jól megválasztott hígításával izolált kolóniák nőnek az egyik csőben (Pasteur pie-csúcsai, Burri csövek). A képződött telepek kivonásához az alábbiak szerint járjon el. Paraffin réteget eltávolítottuk egy steril tűvel, és egy oszlop agar táptalajt óvatosan fújt a csőből egy steril Petri-csészébe, hogy gázt nem tartalmazó oxigént keresztül kapilláris tű vagy forgalomba fala között, a cső és az agar táptalajban. A Burri csőből származó agarizált táptalajt felrobbantjuk, és a gyapotszöveten át vezetjük a gázt.
Bizonyos esetekben a tesztcsőből származó sűrű táptalajt különböző módon kivonják. A csövet kissé felmelegítik, miközben gyorsan forgatják az égő lángja fölé. Ebben az esetben az agar, közvetlenül a fal mellett, megolvad és a cső tartalma agaroszlop formájában könnyen belerakszik egy steril Petri-csészébe. Az agarlemezt steril lancettel vágjuk, és a telepeket extraháljuk, steril kapilláriscsövekkel vagy hurokkal rögzítjük. Ezeket steril lándzsa segítségével is kivághatja. A kivont kolóniákat a felszabadult mikroorganizmusok kifejlesztéséhez kedvező folyékony közegbe visszük át. Ha izolált kolóniákat kapillárisban kapnak, a felület alapos fertőtlenítése után steril csipeszekkel törik össze, és az izolált telepeket tartalmazó kapilláris szakaszok steril táptalajra kerülnek.
Az izolált kolóniák mélyvénás módszerrel történő előállítására és a hígítás módjára ajánlott tisztított tápanyagot használni.
A kémcsövek elforgatásának módja. Ha olyan kötelezõ anaerob baktériumok izolált kolóniáit akarják megszerezni, melyeket különösen nagy oxigénérzékenység jellemez (extrém anaerobok), akkor használja a csövek elforgatásának módját. Ennek lényege a következő. A megolvasztott agarizált tápközeget baktériumokkal fertőztük állandó áramban egy steril inert gázcsőben, amely az oxigénszennyeződéstől mentes. A csövet ezután gumitömlõvel lezárjuk és vízszintesen elhelyezzük a csõben elforgatható bilincsben. Az agar tápközeg egyenletesen oszlik el a cső falán, és egy vékony réteggel megszilárdul. Az agar táptalaj egy vékony rétege egy gázkeverékkel töltött kémcsőben lehetővé teszi olyan izolált telepek előállítását, amelyek jól láthatóak a szemmel (lásd a 6.4. Ábrát). Az R.Hangate-módszer módosítását is alkalmazni kell. Ebben az esetben a megolvadt agar táptalajt egy steril inert gáz állandó áramában tesztcsövekbe öntjük. A csövet ezután egy gumidugóval lezárják, és vízszintesen helyezkednek el a cső forgatásához. Miután a keret fali-esek cső megkeményedik termelnek telepítő táptalajban a csőben áramló steril gázt vezetünk át egy kaccsal, vezető rúd egy forgó csőben az irányt képez a fenekétől a nyak (ábra. 6.5). Néha, hogy tiszta termést kapjunk, elég sűrű táptalajban ülünk, de gyakrabban a sűrű tápközegben a vetés 2-3 alkalommal megismétlődik. Vetőmagként egy külön kolóniából nyert kultúrát használunk.