Klónozás ugrással
Klónozás ugrással. Génkönyvtárak létrehozása és szűrése.
A módszer a klónozás azt jelenti, „ugrás a kromoszómán,” lehetővé teszi számunkra, hogy meghatározzák azokat a területeket, amelyek el vannak választva egymástól több százezer nukleotidok nem elszigetelt köztes szekvencia. Ahhoz, hogy hozzon létre egy gén könyvtár „kromoszóma ugró” tartsa redkoschepyaschey restrikciós enzimmel emésztett genomiális DNS-t (általában legkényelmesebb enzim restrikciós helyek, amelyek a parttól körülbelül 200 kbp hossza a folytatásban). Ezeket a fragmenseket ligáljuk egy kis marker gént, tipikusan egy gént supF (hossz = 7 kbp) fág X, ami a ciklizáció fragmens. Ennek eredményeképpen a végső régiók kezdetben több száz kb távolságban vannak. csak a markergén hossza által távolítják el egymástól. Feldolgozása után restrikciós enzimmel sredneschepyaschey gyűrű alakú molekula (leggyakrabban használt EcoR1), a kiválasztott fragmensek körülbelül 20 kb amelyek közül a markergént és a szekvenciákat szegélyezik. Vektorba illesztéskor csak a gént tartalmazó szekvenciák amplifikálódnak a negatív marker gén gazdasejteiben.
Ezután a klónt DNS-próbával történő hibridizációval azonosítjuk. az eredeti szekvenciára jellemző. Az ezt követő szubklónozás során két szubklónt kapunk a plazmidvektorban. Az egyik szubklón az eredeti szekvenciára specifikus DNS-próbával hibridizál, a második - nem hibridizál ezzel a DNS-próbával és olyan DNS-fragmenst tartalmaz, amely az eredeti molekula eredetétől az ugrás hosszától elkülönül.
A genomikus könyvtárak létrehozása után. amelyek nagy DNS-fragmenseket tartalmaznak, és a kontig térképei, a "járás" és a "kromoszóma felugrása" módszerei elvesztették jelentőségüket.
A gének könyvtárai és azok szűrése. Alapján klónozási technológia, amely lehetővé teszi, hogy észleli egy adott DNS-fragmenst, és a fogadó ez a kívánt mennyiségben, a génkönyvtár épített forrásaként szolgáló különböző DNS-fragmensek. Gene Könyvtár - egy teljes készlet átfedő klónozott DNS-fragmensek, amelyek eredményeként a emésztéssel vagy mechanikai vágása az eredeti DNS-molekula, származhatnak bármilyen biológiai anyag (szövet-, sejt- kultúrákban, egyes kromoszómák vagy fragmensei). A számos különböző klónok a könyvtár vagy információs kapacitás függ a mérete az eredeti DNS-t (genom), és a kötelező jelenléte minden darab legalább egy klón. Az optimális mérete átfedő fragmensek klónozására, hogy hozzon létre egy génkönyvtár kell egyeznie az átlagos mérete a gén az állatfaj vagy az élő szervezetek (emlős - 15-25 kb), amelyre jön létre.
A könyvtár tartalmazhat minden faj genomiális DNS-ét (exonok, intronok és intergenikus régiók) vagy csak kódoló szekvenciákat.
Könyvtár. a teljes genomiális DNS alapján, beleértve az exonokat, az intronokat és az intergénikus régiókat genomikusnak nevezik. Az emlősök genomikus könyvtárainak információs kapacitása legalább 8 * 105-106. Az optimális méretű fragmenseket az emberi genomi DNS-ből frekvencia restrikciós endonukleázzal történő restrikcióval nyerjük. Mondjuk 3A vagy Mbol.
A cDNS könyvtárak csak exonokból állnak. A mRNS reverz transzkripciójával kapott cDNS-ből állítják elő, amely a vizsgált géneket expresszáló biológiai anyagból izolálódik. Vannak könyvtárak az ex-pressed cDNS-től és a szelektív cDNS-től.
A DNS / cDNS megszerzése után. ez darabokra vágjuk, amelyek hossza függ a kiválasztott klónozó vektorba, és a konstruált vektor rendszer, attól függően, hogy a választott klónozó vektort megkülönböztetni YAC-, BAC (mesterséges bakteriális kromoszómák) - és PAC (plazmid mesterséges kromoszómák) Könyvtár tartalmazó nagy DNS-fragmensek személy. A gének fág- és kozmidkönyvtárai a legkényelmesebbek a nagy mennyiségű kiméra DNS tárolására. A gének könyvtárainak létrehozásához fág, kozmikus és YAC rendszereket használnak. A gének YAC-könyvtárai az emberi genomikus DNS fragmentumai 1 mln-ig terjednek. "Varrva" az élesztő kromoszómák centromerikus régióival. Azonosítás után a kívánt klón könyvtár YAC-lépésbetét rész szubklónozhatjuk fág vagy kozmid könyvtárakat. A leginkább célszerűen a humán génkönyvtárat készítünk alkalmazásával klónozó vektorok alapuló fág X - EMBL3 és EMBL4. Ennek oka a vektorok jellemzői: a csomagolási képesség intervalluma 9-23 kb; számos alkalmas klónozóhely jelenléte (amely különböző restrikciós enzimek használatát teszi lehetővé a DNS-fragmensek behelyezéséhez); hiánya pBR322 szekvenciák és plazmidok ColE1, leggyakrabban a klónozáshoz használt (amely lehetővé teszi kiválasztását a kívánt klónok fág DNS-t, nem betétkés).
Gének szűrési könyvtárai. keresni a kívánt DNS-szekvenciákat A szűrési módszer kiválasztása a szekvenciák sajátosságaitól függ. Könyvtárak szkrínelésére általában használja blot hibridizáció DNS-próbákat (oligonukleotid, DNS-t és a többi), vagy immunnoblot specifikus antitestekkel (ha a könyvtárat alapján tervezett eksprecciruyuschego vektor). Screening posledovatelngh több lépésből: vetés kiméra fág könyvtárat a gyep a baktériumok növekvő felületén egy szilárd táptalajt Petri csészékben (mindegyik litikus plakk a bakteriális gyep - a sejtek fertőzését eredményez egy fág klón); "Újranyomtatni" a kapott növényeket más Petri-csészékkel annak érdekében, hogy megkettőzzék őket; a növekvő és lizált kiindulási kolóniák transzportja egy szűrőbe, a sejtmembránok egyidejű megsemmisítésével, a fehérjék és a DNS rögzítésével; blot-hibridizáció jelzett DNS-próbával vagy immunoblot-val jelzett antitestekkel (expressziós könyvtárakhoz). Az utolsó lépés a szűrés magában foglalja a azonosítását pozitív fágokat autoradiográfiával telepeket (eltávolítása után a nem kötött DNS-próbák és antitestek sötét folt az X-ray film fog megjelenni a helyeken a lokalizáció telepeket, amelyek a komplementer próba DNS-fragmentum vagy a specifikus antigén), és kiválasztásuk a dupla tenyészetekben. A hibák elkerülése érdekében a kiválasztott telepek többszörös szűrését végezzük.
Továbbá annak érdekében, hogy a kiválasztott fragmens elegendő mennyiségét nyerjék vizsgálathoz vagy DNS-próbához való alkalmazásra, plazmid vektorba szubklónozzuk.