DNS-könyvtárak használt szekvenálása a genom a fajták és hogyan lehet létrehozni

A restrikciós fragmentumokat a genomiális DNS-t és klónozását fragmentumok különböző kialakított vektorok alapján kialakulását genomiális könyvtárak.

Építőipari genomi könyvtárak jelenti építőiparban a DNS-fragmentumok. hogy a használt szekvenálás. Vannak 2 változatai az építési ezen könyvtárak:

· Az in vivo jellemző az I. generációs technikák ELŐNYÖK: Libraries készítette in vivo is fel lehet használni más dolgokat .. feltérképezése genomok pl

Tartalmazza hierarchikus megközelítés

· In vitro a jellemző II generációs technikák, kényelmesebb használni

Tartalmazza shotgun -Alkalmasság

A genomi könyvtárból. Ha a szervezet genomjába vágni, illessze be egy plazmid vagy virális vektor, és bejuttatjuk egy sejtbe, tárolható ebben a formában. Amikor vágás a plazmid vagy fág DNS valószínűségét egészében és változatlan darab a genom elég magas.

Ez a módszer a termelő genomi könyvtár úgynevezett „shotgun szekvenálás”, hiszen ebben az esetben a gén tartalmazza az egyes töredékek.

Alapelvei létrehozása plazmid és virális vektorok átfogó, ezért tartjuk őket a példa a plazmid. Meg kell jegyezni, hogy mivel a vírus-DNS jobb használni DNS fágok, mert van egy nagyobb kapacitású és lehetővé teszi, hogy helyezze be a nagyobb darabokat a genomban.
Tisztított cirkuláris DNS-molekula, kezeljük egy restrikciós enzimmel, így lineáris DNS-t. A celluláris DNS-t kezelünk az ugyanazzal a restrikciós enzimmel, plazmidot adunk, ligázt adunk hozzá. Az így kapott rekombináns plazmid DNS-t, amelyet be lehet vezetni baktérium- vagy élesztősejtek. A plazmid szaporodik, így sok példányban. Számos plazmid hordoz egy gént antibiotikum-rezisztencia, és ha a rekombináns plazmidot egy olyan gén a sejteket könnyen azonosítható nő a közegben egy antibiotikum.
Mindegyik kolónia utóda vagy klónja egyetlen sejt. Tartalmazó plazmidokat egyetlen telepet klón genom DNS és plazmidok aggregált lehet nevezni genomi DNS-könyvtárat. A hátránya ennek a módszernek, hogy a DNS fragmentumokat állítunk elő nagy mennyiségben. Vágás esetén genomiális DNS-t határozzuk meg, így csak egy része a fragmensek teljes géneket. Egyes fragmenseket csupán egy részét tartalmazhatja egy gén vagy intronszekvenciákat.

cDNS-könyvtár. Készítése cDNS-szintézis kezdődik RNS-templát alapján reverz transzkriptáz komplementer DNS-szál. Ezután létre az alapvető feltételeket elpusztítani RNS-szál nukleotidjainak, majd a DNS-polimeráz szintetizál egy komplementer DNS-szálat. Ez képezi egy olyan DNS-fragmentumot tompa végű. Az ilyen DNS-t plazmidba inszertáltuk, és bevezetjük egy bakteriális sejt. Ha a plazmidot amplifikációs generált klón komplementer DNS másolatot (cDNS).

Előnyök DNS klónozására genomiális DNS klónozására, hogy egy olyan fehérjét kódol, a nukleotid szekvencia a gén nem megszakadt.
A gének eukarióták tartalmaznak intronokat, amelyek el kell távolítani a transkriptnoy RNS konvertálása előtt egy mátrixba, majd splicing (splicing). A bakteriális sejtek nem tudja elvégezni ilyen módosítást a képződő RNS transzkripcióját az eukarióta sejtek gén. Ezért, ha folytat fehérje készítmény expressziójával egy klónozott gén, akkor jobb, hogy egy cDNS-könyvtár alapján készített hírvivő RNS.

Vektorok - adaptált klónozására idegen DNS-fragmensek a molekulák az összetételében:

1. A replikációs origó (Ori)

2. Szelektív marker (antibiotikum rezisztencia gént)

3. Restrektsionnye oldalak klónozásra alkalmas.

Szintén a vektorok tartalmazhatnak:

· Szabályozó géneket raspredilenie példányban vektor muzhdu leánysejtekhez (alacsony példányszámú vektorokat)

· A telomer-szekvencia (a lineáris vektorok)

Vektorok használt Genome Projects

2. fágvektoroké

4. mesterséges kromoszómák

A plazmidok. pUC. 90% A szekvenciák történik ezen a plazmidon. Nagyon ritka esetekben, tett néhány más vektor, de azonos típusú - egy kis magas példányát bakteriális plazmid. Arra használják, mert Ez a nagy kópiaszámú plazmid jelen van a sejtben akár 1000 példányban, könnyen izolálni és annak koncentrációját a készítményben magas, így könnyen tisztítható. Ahhoz, hogy kiváló minőségű DNS .... Technológiailag vektor ilyen szekvenálás a legjobb minőségű, így a nagy részét a szekvenálás végzett ilyen plazmidok. Ugyanezzel az eljárással egy nagy kópiaszámú könnyen robotizálta. Járó hátrányok nagy kópiaszám:

Egyes töredékek genomi DNS-klón alapvetően lehetetlen ezekben a plazmidok még egy normális celluláris gén, ha a példányszámot növeli sokszor lehet, hogy károsítják a sejteket. Az eukarióta gének is toxikus lehet a bakteriális sejt. 5-10% a genom klónozott ebben a vektorban a nem lehet toxicitás miatt problémák.

Az ilyen vektorok nem hosszabbítható klónozására DNS-fragmenseket a több, mint néhány kb- Amikor pUC történő beépítésével 20-30 kb plazmidok instabillá vált plazmid kópiaszáma azonos, körülbelül 50% a DNS-t a sejt lehet egy plazmid. Van egy erős szelektív nyomást, hogy csökkentsék a DNS mennyiségét. Van egy folyamatban lévő rekombinációs folyamatok átszervezése is előfordulhat elég könnyen, különösen törlések és inverzió. Bármilyen átalakítása a plazmid lefelé lesz felvette a természetes szelekció. Viszonylag stabil a betétek nem több, mint 1,5-2 kb-

Fágvektoroké. Ők mindig nagyobb kapacitást, ha a behelyezés vektor, amelynek kapacitása mintegy 10? kb Ha a fág lambda helyettesítési vektor - 20? kb Ezen túlmenően, amikor a reprodukció bakteriof nem az a kérdés a toxicitás, mivel reprodukció során fág sejt elpusztul minden esetben, és a fág replikációját, és a csomag a DNS-ét az időben. Ez az egyetlen ok, amiért a fágvektoroké még mindig használják a genom projektek. Kivéve egy igen egzotikus esetben a klónozott gének fág vektor nincs esélye, hogy megakadályozzák a szorzás a fág, és ha úgy dönt a megfelelő törzseket fágok, a problémák kevesebb átrendeződések. Úgy véljük, hogy a helyettesítés fág vektorok elég stabil, és még mindig használják a nagy genomi projektek, amikor szükség van a felzárkóztatásért, hogy nem lehet klónozott más könyvtárakban. Hátrányok: fág DNS kiosztani sokkal kevésbé kényelmes (bonyolultabb technika, sokkal munkaigényesebb, nehéz automatizálni). Ezért fág vektorokat általánosan használt a befejező fázisban, amikor a szükség, hogy lezárja a rések.

Kozmidvektort. Ez egy hibrid plazmidból és egy bakteriofág. Kép rossz: legyen 2 cos helyszínen. Előtt a 90. volt egy maximális kapacitása vektorok (képest növekedett a bakteriofág 2-szer). Méret kozmidok 53 kb- (Maximum, amely bekerül a feje a lambda-fág), mínusz a méret a vektor - a 45-51 kb nagyságú kapacitását. Normál kozmid hordoz 2 cos-site óta fág általában csomag a fej lineáris DNS két cos-oldalakat. Előállítása kozmid könyvtár - sokkal időigényes, de ezek a könyvtárak tekinthetők a könyvtárak a jó minőségű, mintha előállított magas titere a fágrészecskék, DNS nem szükséges újra amplifikáljuk könyvtár és stabil maradt sokáig. Bármikor képes megfertőzni ezeket kozmidok bakteriális sejteket, és így a megfelelő géneket.

Élesztő mesterséges kromoszómák. Ezeket a vektorokat kifejezetten a projekt „Human Genome”. Ez a program hivatalosan is elindította a késő 90-es években. Az első szakasz a projekt kidolgozása volt vektorok. Kifejezetten vektorok a projekt maximális kapacitása lehet alapján bemutatott szegregációs mechanizmus replikáció és az élesztő kromoszóma. Ők fejlesztették, ők építették a könyvtárban. A standard oldat térfogata élesztő vektor - körülbelül 600 kb nagyságú és a mega-YAC - 1,4 milliárd. Ie kaphat 6-7000. klónt, és ez lesz a teljes emberi genom. Dolgoztunk velük 5 éves, kapott egy könyvtár és valahol a '90 -es évek közepén világossá vált, hogy ezek a élesztőkiónok nagy lapkák nagyon instabil. DNS tárolja rosszul, meg kell tartani az élesztőben, és ott van a helyzet ugyanaz, mint a nagy betétek a plazmidok a baktériumok, csak egy sokkal súlyosabb változata: több belső átszervezés, törlések, áttelepítések, stb Oly nehéz prokartirovannnye könyvtár kötve egy fizikai kártya kiderült, hogy semmi nem illik, mert nem a DNS-t, ami az eredeti emberi genomban.