vektor fogalma
A molekuláris klónozás a kívánt inszerciós egy DNS-fragmens egy másik DNS-molekula, amely képes replikálódni (ben kódolt információ a szülői DNS bázis szekvenciáját továbbítjuk pontossággal leányvállalata DNS) egy megfelelő gazdasejtbe. A DNS-molekulák átviteléhez használt anyagot a beágyazott bakteriális sejtek, az úgynevezett vektorok. Ez behelyezés történik in vitro, majd a kapott rekombináns DNS-t juttatunk be a sejtekbe.
Vektor molekulát kell feltétlenül tartalmaznia a replikációs origót - ori. Ezen túlmenően, annak szükségességét, hogy lemásolni specifikus enzimek és kiegészítő fehérje faktorok. Ezek forrása a gazdasejt vagy azok által kódolt vektor. A vektor lehet bármilyen kis extrakromoszomális elem - egy plazmid, fág DNS vagy vírus-DNS, kozmidok, phasmids.
A legszélesebb körben alkalmazott ilyen kombináció, ha a master szerepet kiáll az E. coli K12 törzs, és a szerepe a vektor - a különböző plazmidok és fágok, az E. coli. Az előnyös használata a törzs annak a ténynek köszönhető, hogy pontosan az E. coli K12 sejtekben akadálytalanul replikálódik sok bakteriofágok és plazmidok, hogy lehet használni, mint egy potenciálisan hasznos vektorok, és ez a törzs a leginkább tanulmányozott.
Klassifikatsiruyut plazmid fej látnia a bennük való jelenléte moduláris szegmenseit DNS. Minden egyes moduláris szegmens tartalmazhat egy vagy több gén vagy cisz -action elemek, mint például, lókusz ori. Mindegyik plazmid kell legalább egy replikációs modul, amely lehetővé teszi számára, hogy aktívan reprodukálni a recipiens sejtben. A jelenléte más modulok, más, mint a replikáció, nem szükséges minden egyes plazmid.
Szexuális tényezők konyugativnymi nevű plazmid. (Például F-plazmid) olyan konjugációs tartalmazó modulok gének és szabályozó régiók szükséges plazmid az egyik cellából a másikba. Néhány a nekonyugativnyh plazmidok (nélkül konjugáció modul) átvihetők az egyik cellából a másikba, ha azok együtt egy donor cellát a szex faktor.
A modulok más típusú gének, a protein termékek, amelyek a inaktiválása antibiotikumok. Hordozó plazmidok ezek a modulok, gyakran nevezik az R-plazmidok (az angol ellenállás -. Ellenállás). Gyakran az egyik plazmid rezisztenciát több antibiotikummal, és több vagy akár az összes gén rezisztencia különböző típusú lehet csoportosítani egy modulban.
Van egy másik típusú modulokat, amely megtalálható az összetétel hogyan konyugativnyh és nekonyugativnyh plazmidok - ez gyűjtse modulokat. Col-modulok kódoló gének egyike a számos fehérje - colicins - antibakteriális szerek a baktériumok által termelt. Colicin különböznek szerkezete és hatásmechanizmusa. Nagyon gyakran gyűjtse kódoló plazmidok bizonyos colicin tartalmaznak géneket immunitás colicin, ezáltal védi a termelő sejt által okozott károktól saját védelmi eszközökkel.
A plazmidokat az eredetileg felfedezett jellegűek, azokat utólag módosított, csonkolt, és vetjük alá rekombinációs rekonstruált mind in vivo, és olyan körülmények között in vitro. A cél az összes ilyen manipulációk volt, hogy az egyetemes plazmidok, vagy pedig a plazmidok, hogy néhány konkrét kísérleti problémák. Legtöbbjük tartalmaznak genetikai markerek, hogy egyszerűsítse a kiválasztás a bakteriális sejt, amely tartalmaz egy rekombináns molekula.
Amellett, hogy a genetikai markerek különböztethetők sejtek bakteriális klónokat, amelyek a rekombináns plazmidot, az általuk végzett egy másik fontos funkciója. Ha egy plazmid bizonyos körülmények között nem teljesíti feladatát, a sejtek hajlamosak növekedni és szaporodni hatékonyabban hiányában az „extra” kívüli DNS. Ezért azok a sejtek, melyek elvesztették plazmid gyorsan kinövi másik, rekombináns megszűnt. Ellenkező esetben, ha a sejtek olyan körülmények között, ahol a túlélési függ plazmidvektor elvesztett sejtek eliminálódnak.
Tulajdonságai ideális plazmid vektor. Ideális plazmid vektor a klónozás számára meg kell felelnie az alábbi követelményeknek:
1. A vektornak tartalmaznia kell egy minimális mennyiségű DNS-t;
2. Az a vektor replikációjához kell vezérelnie a típusa attenuált - (ami a megjelenése számos sejt plazmid kópia), és nem egy szigorú ellenőrzés, hogy magas kitermeléssel DNS;
3. A vektornak tartalmaznia kell legalább két szelekciós markert és egy felismerési hely restrikciós. Az utóbbi tulajdonság lehetővé teszi, hogy csökkentsék a kör alakú DNS-t egy egyedi helyet, amely ezt követően elvégzi ligációkat a betéttel;
4. a lehető legegyszerűbb transzformánsok kiválasztására, egyedi restrikciós belül kell elhelyezni a két szelekciós markert
5. A betét ne szakítsa meg szekvenciát megőrzéséhez szükséges legtöbb plazmidot.
Az összes vektorok, ha dolgozik az E. coli, a legnépszerűbb pBR322 plazmid. Ez a plazmid sok olyan tulajdonsággal rendelkezik az ideális klónozó vektorba. Mivel a pBR322 replikálódott Col E1 típusú (Col-E1 egy plazmid, amely képes felhalmozni néhány ezer példányban plazmid genom, akkor is, ha a sejt növekszik, és nem oszlik), a plazmid DNS-t kaphatunk magas hozammal. A plazmid tartalmaz két szelektálható markergén rezisztenciát biztosít és tetraciklinnel és ampicillinnel. Mind a 12 restrikciós enzim felismerő helyek a molekulában található csak egyszer, lehetővé téve, hogy kapnak a különböző lineáris molekulák „ragadós” végeket. Ismert teljes nukleotid-szekvenciáját a vektor hossza 4362 bázispár.
A sejteket E. coli. pBR 322 plazmidot tartalmazó, tápközegben növesztjük ampicillinnel vagy tetraciklinnel vagy jelenlétében mindkét antibiotikumot, és a sejteket, amelyek elvesztették a plazmidot nem nőnek jelenlétében sem antibiotikum. Ha egy DNS-fragmenst viszünk be pBR322, felelős a tetraciklin rezisztencia (például egy restrikciós helyet BamHI vagy Sall), akkor az ilyen transzformánsok megtartják azt a képességüket, hogy növekedni közegbe, ampicillinnel, de nem nőnek a tetraciklint tartalmazó közegben. Ha a beszúrási bekövetkezik ampicillin gént (a restrikciós helyek Pvul vagy Pst I), az ellenkező helyzet figyelhető meg. Mindenesetre lokalizációs helyezze könnyen elvégzi a kiválasztást a csak azokat a bakteriális telepek sejtek, amelyek hordoznak egy rekombináns plazmid-DNS.
A DNS-molekula fág l, amely a 48.502 számú nukleotid bázispárt, tartalmazza a replikációs origót, valamint a gének kódoló virális strukturális fehérjék és enzimek szükséges a DNS replikáció, lízisét fertőzött sejtek és hozzanak létre lizogéniától. Mintegy 30% -a, a genom által képviselt területe felesleges litikus fertőzés. Általános szabály, hogy sok, vagy akár az összes szükséges géneket lysogenesis eltávolítjuk, így a fertőzés E. coli rekombináns vektor mindig kíséri lízis a befogadó sejteket.
M13 fág belép a csoport fonalas bakteriofágok E. coli. A fág genom egyszálú cirkuláris DNS részt. csomagolva egy kapszid. M13 fág képes sejteket fertőzni T.coli csak akkor, ha azok rendelkeznek a F-pilus.
Az ilyen hibrid vektorok közé tartoznak kozmidok és phasmids.
Kozmidot - olyan típusú hibrid vektorok, amelyek a típus által jellemezve plazmid replikációt és rendelkeznek azzal a képességgel, hogy kell csomagolni in vitro körülmények között a fág fej L. Tipikus kozmid tartalmazza a replikációs origót tartalmaz egyedi restrikciós helyek, és szelektálható markerek tartozó plazmid DNS-t, amely integrált DNS-fragmenst fág l, fágot tartalmazó „ragadós” végek (cos -cayty). A recipiens gazdasejtekben válnak csomagolt virionokba kozmidok fertőzés okozta „hamis” fág részecskék. A sejtben, a rekombináns DNS-t amplifikáljuk, és abban tároljuk a plazmidok formájában.
A kozmidok lényegében plazmid vektorokat, amelyek csak cos -cayt fág l, szükséges a hatékony csomagolási rekombináns DNS in vitro.
A valódi hibrid plazmidok és fágok phasmids - lineáris duplex DNS-molekula, amelynek területén található a végén a DNS-szegmensek fág l, amely tartalmazza az összes szükséges gének lítikus fertőzés, míg a középső része mutatja, a linearizált plazmid. Replikációs funkciókat, például fággal vagy plazmid a fazmid teljes mértékben megmarad. Jellemzően, az ilyen vektorok tartalmaznak számos ismétlését plazmid része biztosítja az elvárt csomagolására genomi DNS hossza. Egy vagy több ismétlődését plazmid a rekombináns DNS-t helyettesíti a megfelelő betétet.
A fertőzés előtt Fazmidnye DNS in vitro becsomagoljuk fág fejek. A sejtben az E. coli. fazmid DNS replikálódik, mint egy fág, így a pázsit érzékeny sejtek képződött plakkokat. Azonban, ha a vektor egy olyan gént tartalmaz kódoló represszor fág l, fazmid ezután replikálódik, mint egy plazmid, nem pedig a fág.