Bakteriofágok, kozmidok - az átalakulás a baktériumok, mint az alapjául géntechnológia és molekuláris
bakteriofágok
A plazmid vektorok, klónozott DNS-fragmensek hossza legfeljebb 10 m. N. N. Azonban, amikor létrehoztuk genomi könyvtárak gyakran dolgozik együtt nagyobb töredékek. Erre a célra, vektorok alapján bakteriofág l E. coli fejlesztettek.
Miután behatolását a sejtbe események alakulhatnak ki két forgatókönyvet. Amikor végre litikus ciklus a fág, amely kezd gyorsan proliferálódó, majd körülbelül 20 perc, a sejt összeesik (lizálja), hogy kiadja a 100 új fág részecskék. Egy alternatív kiviteli alaknál a fág DNS a kromoszómába az események tartalmazza az E. coli, mint egy profágot a cellában, és együtt replikálódik a szokásos bakteriális gének (lizogéniától állapotban).
Azonban hiányzik a tápanyagok vagy más kedvezőtlen körülmények között integrált fág DNS felszabadul, és litikus ciklus fejlesztés. A méret a fág DNS-t körülbelül 50T. n. n. ahol annak jelentős részét (körülbelül 20 m. u. n.) elhanyagolható fág szaporítására és felelős annak beépülését a gazdasejt DNS-t. Ebben a tekintetben, a gondolat, hogy ez lehet helyettesíteni más DNS-fragmens azonos méretű. Az így kapott rekombináns molekula replikálódnak a sejtben, mint egy DNS „rekombináns” fág „emelkedett” a litikus fejlődését.
Ahhoz, hogy megértsük, hogy a vektor rendszer alapján fág, meg kell vizsgálni a molekuláris szempontok a litikus ciklus. Fertőző fág részecske van egy feje, amely zárt szorosan csomagolt DNS körülbelül 50 m. N. N. valamint egy eljárás le róla a vékony fehérje szálak (fibrillumok). Assemblage egy fej folyamat és a csomagolás a DNS világosan koordinált. A fág DNS-t - egy lineáris két-láncú molekula hossza 50 m egy n ... egy egyszálú 5 „-»farok«12 nukleotid. Ezek az úgynevezett ragadós (cos) végződik, mert kölcsönösen kiegészítik egymást, és párosodnak egymással. Miután a fág-DNS átmegy a folyamatot, és az E. coli, COS-végeket összekapcsolódva egy cirkuláris molekula. Ez képezi egy lineáris molekula, amely több hosszúságú szegmenst 50 m. O. N korai szakaszban eredményeként replikációs DNS-molekulák gyűrű alakú litikus ciklus.
Mindegyik szegmens csomagolva egy fehérje feje az utóbbi csatlakozik a már összeszerelt folyamat, és egy új fág részecskék. Amikor a csomagolás a DNS-molekula kevesebb, mint 38 m. N. N. Ez kapott nem fertőző fág-részecske és fragmenseket több mint 52 m. N. N. Nem fér el a fejét. Szegmensei hossza 50 m. N. N. lineáris DNS-molekula elválasztjuk cos-oldalak, és ez ezekben a pontokban elhasítjuk, hogy a molekula, amikor a következő szegmens kitölti fejét. Vágóeszközök enzim bejáratánál található, hogy a fej.
Ennek eredményeként a vizsgálatok, hogy tanulmányozza a szerelvény fág DNS csomagolási rendszer került kidolgozásra in vitro, hogy fertőző fág részecskék. Keverés in vitro hámozott üres fej, a fág DNS-t összegyűjtjük, és folyamatok kaphatnak fertőző fág részecskéket.
A feladat áll vtom kutatók helyett a középső része a nukleotid szekvenciája körülbelül 20 m. N. N. a kívánt DNS-t. DNS szánt klónozás, szintén át fragmensekké emésztettük terjedő méretben 15 do21 t. N. N. Mindkét szer - fág és a heterológ DNS-t - DNS egyesítjük és - ligáz. DNS-fragmenseket 50 m. N. N. csomagolva a fej, azok csatlakozott folyamatok és képez fertőző fág részecskék. Fragments nagyobb (> 52 m. N. N.) vagy ennél kisebb (<38 т. п. н.) размера упаковываться не могут.
Hibrid plazmidok és fág. Tény, hogy ez csak egy plazmidot, amelynek helyek kötődését a fág burokfehérjéinek (ún cos-oldalakat, és ekkor kapta a nevét, mert kozmidok). Protein héj teszi kozmid stabil, ami lehetővé teszi betölteni hosszabb betéttel.
Vektorok úgynevezett kozmid tartalmazhat akár 40 m. N. N. az idegen DNS-t, és ahol az aktív amilifipitsirovatsya E. coliban, mint egy plazmid. A kozmidok tulajdonságait egyesítik plazmid vektorok és vektorok alapuló fág. Például a széles körben használt kozmid pLFR-5 (körülbelül 6 m. N. N.) két cos-site fág elválasztjuk restrikciós hely, egy polilinkert hat egyedi restrikciós helyek, egy DNS-replikációs origót (Ori) és a tetraciklin rezisztencia gén ( Tc). Ez kozmid lehet integrálni az idegen DNS egy hossza 40 m. N. N. DNS-preparátumot összekeverjük és ligáljuk. Azok ötvöző termékek, amelyek egy behelyezési hossza 40 m. N. N. van egy teljes mérete közel 50 m. n. n. és ezért lehet in vitro becsomagoljuk fág fejek. Újratársításához molekula pLFR-5 nem inszerteket tartalmazó csomagolt nem. Az összeszerelés után a fág részecskék E. coli fertőzésére.
Caught egy bakteriális sejtben, lineáris molekula egy betétkés van zárva a gyűrűt, köszönhetően a párosítás a COS-helyek. Ilyen konfiguráció, hogy stabil hosszú ideig lehet reprodukálni a sejtben, és a hibrid plazmid, mert ez tartalmazza az összes szükséges elem. Ezen túlmenően, a tetraciklin rezisztencia gén biztosítja a tenyészetek növekedését során ez kozmid. Kozmidokra van egy nagy előnye képest plazmidok beépíthetők több hosszabbítani töredékek, és ez azt jelenti, hogy meg kell kevesebb klón és kevesebb időre van szüksége létrehozhatják saját szűrési genomi könyvtárak.