Génterápia genetikai betegségek kezelésére
Az egyik legszörnyűbb betegség, amellyel a természet "átadja" az embert, genetikai betegségek. Sikeresen küzdhet a betegségek - baktériumok és vírusok kórokozói ellen, de ha a probléma az emberi genomban született, akkor rendkívül nehéz segíteni a pácienst. A modern tudomány folyamatosan törekszik arra, hogy megjavítsa a mutált géneket.
Duchenne's myodystrophia az egyik ritkán előforduló, de még mindig viszonylag gyakori genetikai betegség. A betegséget három-öt éves korban diagnosztizálták, rendszerint fiúknál, akik kezdetben csak nehéz mozdulatokban nyilvánultak meg, tízéves korukig, ilyen myodystrophia szenvedése már nem képes járni, 20-22 évig az élete véget ér. Ezt a X-kromoszómában található disztrofin-gén mutációja okozza. Olyan fehérjét kódol, amely összekapcsolja az izomsejt membránját összehúzó szálakkal. Funkcionálisan ez egyfajta tavasz, amely a sejtmembrán sima összehúzódását és integritását biztosítja. A génmutációk a vázizomzat, a membrán és a szív elváltozásához vezetnek. A betegség kezelése palliatív, és csak kis mértékben enyhíti a szenvedést. Azonban a géntechnológia fejlődésével a fény megjelent az alagút végén.
A génterápia a genetikai betegségek kezelésében nukleinsav alapú konstrukciók sejtjein belüli szállítás. Az ilyen terápia segítségével a genetikai problémát a DNS és az RNS szintjén korrigálhatjuk, megváltoztatva a kívánt fehérje kifejeződési folyamatát. Például a DNS-t korrigált szekvenciával szállíthatjuk a sejtbe, amelyből egy funkcionális fehérje szintetizálódik. Vagy ellenkezőleg, bizonyos genetikai szekvenciák eltávolíthatók, amelyek szintén segítenek a mutáció káros hatásainak csökkentésében. Elméletileg ez egyszerű, de a gyakorlatban a génterápia a mikrovilág tárgyaihoz való legkomplexebb technológiákon alapul, és a molekuláris biológia területén fejlett tudás-készletet képvisel.
„Disztrofin gén, amelynek mutációi ad okot Duchenne izomsorvadás, nagy - mondja a rendező a fejlesztés a biotechnológiai cég” Marlin Biotech”, PhD, Vadim Zhernovka. - 2,5 millió pár nukleotidot tartalmaz, ami összehasonlítható a "Háború és béke" regényben található betűk számával. És képzeljük el, hogy néhány fontos oldalról kikerültünk az epikusról. Ha ezek az oldalak jelentős eseményeket írnak le, akkor nehéz lenne megérteni a könyvet. De a gén bonyolultabb. A "Háború és béke" másolatát könnyű megtalálni, majd a hiányzó oldalak olvashatók. De a dystrofin gén az X kromoszómában van, és a férfiakban ez egy. Így a nemi kromoszómákban a fiúk csak a gén egy példányán születnek. Nincs máshol elfogadni egy barátot.
Végül az RNS-ből származó fehérje szintézisében fontos az olvasási keret megőrzése. Az olvasási keret azt határozza meg, hogy a három nukleotid közül melyik csoportot kodonként olvasjuk, amely megfelel a fehérje egy aminosavának. Ha a génben olyan DNS-fragmentum van, amely nem három nukleotid többszöröse, akkor az olvasási keret eltolódik - a kódolás változik. Ezt hasonlíthatjuk össze azzal a helyzetgel, amikor a könyv hátralévõ részében a levágott lapok után az összes betût betûrendben helyettesíti a következõ. Kiderül abracadabra. Ugyanez történik a helytelenül szintetizált fehérjével. "
A normál fehérjeszintézis helyreállításához a génterápia egyik hatékony módszere az exonok kis nukleotidszekvenciákkal való kihagyása. A "Marlin Biotech" -ben a módszer segítségével a dystrofin génnel való együttműködést kidolgozták. Mint ismeretes, a transzkripció során (az RNS-szintézis) első kialakítva egy úgynevezett prematrichnaya RNS magában foglalja mind a fehérje kódoló részeket (exonok) és a nem-kódoló (intron). Ezután elkezdődik a kötődési folyamat, amelynek során az intronok és az exonok egymástól elválnak, és csak egy "érett" RNS-t alkotnak, amely csak exonokból áll. Ezen a ponton néhány exon blokkolható, "fagyasztva" speciális molekulák segítségével. Ennek eredményeként az érett RNS nem kódoló régiókban, ahonnan mi inkább megszabadulni, és így helyreállt a leolvasási keret, fehérje szintetizálódik.
"In vitro diagnosztizáltuk ezt a technológiát" - mondja Vadim Zhernovkov, vagyis a Duchenne-májdisztrófiában szenvedő betegek sejtjeiből termesztett sejtkultúrákon. De az egyes sejtek nem egy szervezet. A sejtek folyamatainak megsemmisítése, a következményeket élőben kell figyelemmel kísérnünk, de nem lehet az embereket különböző okokból bevonni a próbákba, az etikai és a szervezeti részektől. Ezért szükségessé vált egy Duchenne-modyodrophia modelljének megszerzése bizonyos mutációk alapján egy laboratóriumi állat alapján. "
A mikrokozmosz megcsípése
A transzgenikus állatok a laboratóriumban előállított állatok, amelyek genomjában szándékosan szándékosan változtattak. Már az 1970-es években világossá vált, hogy a transzgének létrehozása a legfontosabb módszer a gének és fehérjék funkcióinak tanulmányozására. A teljesen genetikailag módosított szervezet megszerzésének egyik legkorábbi módja a megtermékenyített petesejtek zygotjainak pronukleuszba (a mag "prekurzorába") való bejuttatása. Ez logikus, mivel az állat genomjának módosítása a fejlődés kezdetén a legegyszerűbb.
A zigóta magjára való befecskendezés nagyon nem vitás eljárás, mivel mikroszkópos. Az egér tojása átmérője 100 μm, a pronukleusz pedig 20 μm. A művelet 400-szorosára növeli a mikroszkópot, de az injekció a leginkább az, amelyik sem a kézi munka sem. Természetesen a "befecskendezés" nem hagyományos fecskendő, hanem speciális üvegtű, amelynek üreges csatornája van, ahol a génanyagot beírják. Az egyik vége a kézben tartható, a másik - ultra vékony és éles - szinte láthatatlan a szabad szemmel. Természetesen egy ilyen törékeny boroszilikát üvegszerkezetet hosszú ideig nem lehet tárolni, így a laboratóriumnak olyan készletei vannak, amelyeket előzetesen közvetlenül egy speciális gépen kihúztak. Egy speciális rendszert használnak a festés nélküli sejtek vizuális megjelenítésére, a beavatkozás maga a pronukleumban traumatikus és a sejtek túlélésének kockázati tényezője. A festék egy másik tényező lenne. Szerencsére a tojások nagyon szívósak, de a zigóták száma, amelyek transzgenikus állatokat eredményeznek, csak az összes olyan petesejtnek csak néhány százaléka, amelyekbe a DNS-t befecskendezték.
A következő lépés műtéti. Egy műveletet hajtanak végre a mikroinjektált zigóták átültetésére a recipiens egér oviductusának tölcsérébe, amely a későbbi transzgének helyettesítésére szolgál. Továbbá a laboratóriumi állatok természetesen terhességi cikluson mennek keresztül, és az utódok születnek. Általában a transzgenikus egerek körülbelül 20% -a megtalálható az alomban, ami azt is jelzi, hogy a módszer tökéletlensége, mert a véletlenszerűség nagy elemét tartalmazza. Injektáláskor a kutató nem tudja pontosan ellenőrizni, hogy a beillesztett DNS-fragmensek milyen módon helyezkednek el a jövőbeli szervezet genomjába. Az ilyen kombinációk valószínűsége magas, ami az állat embrionális szakaszában bekövetkező halálához vezet. Mindazonáltal a módszer működik és alkalmas számos tudományos célra.
Olló a DNS-hez
De van egy sokkal hatékonyabb módszer, amely a célzott genom szerkesztésen alapul CRISPR / Cas9 technológiával. "Ma a molekuláris biológia kissé olyan, mint a távoli tengeri expedíciók korszaka" - mondja Vadim Zhernovkov. - Szinte minden évben ebben a tudományban vannak olyan jelentős felfedezések, amelyek megváltoztathatják életünket. Például néhány évvel ezelőtt a mikrobiológusok felfedezték a vírusfertőzések immunitását egy hosszú látszólag vizsgált baktériumfajokban. Ennek eredményeként a további vizsgálatok során kiderült, hogy a bakteriális DNS-t tartalmaz egy adott lókusz (CRISPR), amelyből a szintetizált RNS-fragmensek képesek, hogy kiegészítő módon kötődnek nukleinsavak idegen elemek, mint például a DNS-vagy RNS-vírusok. Ezzel az RNS-sel kötődik a Cas9 fehérje, amely egy enzim-nukleáz. Az RNS útmutató szolgál a Cas9 azonosítására, amely egy olyan DNS-régiót jelöl, amelyben a nukleáz lefejt. Körülbelül 3-5 évvel ezelőtt, az első tudományos munka, amely alakult CRISPR / Cas9 technológia genom szerkesztést. "
Összehasonlítva a módszer bevezetésének konstrukciók véletlenszerű inszertálásával, az új módszer lehetővé teszi, hogy vegye fel elemek CRISPR / Cas9 rendszert úgy, hogy az pontosan megcélozni RNS útmutatókat a kívánt részeit a genom és elérni a célzott delécióját vagy inszercióját a kívánt DNS-szekvencia. Ebben az eljárásban is, lehetséges hibák (RNS útmutató néha nem kapcsolódik a részét, amelyben orientálják ő), de CRISPR / Cas9 hatékonyság létrehozása transzgének már mintegy 80%. "Ez a módszer széles kilátásokkal rendelkezik, és nemcsak transzgének létrehozására, hanem más területekre is, különösen a génterápiára" - mondja Vadim Zhernovkov. "Azonban a technológia csak az út elején áll, és képzeljük el, hogy a CRISPR / Cas9 segítségével nehéz lesz korrigálni az emberek kódját a közeljövőben. Bár fennáll a hiba lehetősége, fennáll annak a veszélye is, hogy egy személy elveszítené a genom egyik fontos kódoló részét. "
Orosz cég „Marlin Biotech” sikerült létrehozni transzgénikus egér, amely teljes mértékben reprodukálni eredményező mutáció Duchenne izomsorvadás, és a következő lépés az lesz, teszteli a génterápia technológiának. Ugyanakkor a laboratóriumi állatokon alapuló emberi genetikai betegségek modelljeinek létrehozása nem a transzgének egyetlen lehetséges alkalmazása. Tehát Oroszországban és a nyugati laboratóriumokban a biotechnológia területén folyik a munka, amely lehetővé teszi a gyógyszeripar számára fontos állati eredetű fehérjék megszerzését. Mivel termelők, tehenek vagy kecskék hatással lehetnek arra, hogy megváltoztathatják a tejben lévő fehérjék gyártására szolgáló sejtes berendezést. A tejből lehet kivonni a gyógyszeres fehérjét, amely nem kémiailag, hanem egy természetes mechanizmus segítségével nyerhető ki, ami növeli a hatóanyag hatékonyságát. A jelenleg kifejlesztett technológiával ilyen adagolási egységek elkészítésének fehérjék, mint például humán laktoferrin, prourokináz, lizozim, Katrin, antitrombin, és mások.