Gyakorlati leckét 5
A folyamat során a újratelepítési után tripszinezéssel akkor értékeli a feltétele a sejttenyészet t. E. számolni az összes sejtszám, és azonosítani köztük a halott és az élő sejteket.
Ezekre a célokra, van egy egyszerű módszert számítva a sejteket egy hemocitométerrel (Goryaev kamra).
A sejt szuszpenziót azonos térfogatú 0,1% -os tripánkék. Ez a festék megfesti csak elhalt sejteket.
Grind csiszolt üveg fedőlemez a dia hemocitométert (fehér nyíl) megjelenése előtt Newton gyűrűk, hogy fedezze a vonalkázott terület (kék nyíl).
Ennek eredménye egy rögzített térfogatú kamrát, mivel a lemez élétől fölé emelt felületet árnyékolt pontosan 0,1 mm.
Mindegyik vonalkázott terület áll 9 nagy négyzetének 1x1, t. E. által határolt térfogaton egyes nagy tér egyenlő 1 mm x 1 mm x 0,1 mm = 0,1 mm-es 3.
Visszavonja része színes felfüggesztés Pasteurpipetta és töltse ki a hemocitométert számláló kamra, kapilláris szívás, nem túlcsorduló kamera csatornákat.
Számlálás életképes sejtek egy hemocyméterbe (at R.L.P. Adams)
Count a sejtek száma a négy nagy négyzetek a sarkokban a két satírozott területek.
Hidd sejtek a jobb és a felső határoló vonalak, de nem a sejtek a bal alsó határoló vonalak.
Mivel a nagy mennyiségű négyzet 0,1 mm 3., majd megszorozzuk az átlagos értéke a sejtek számát egy négyzet 10 4. kap a sejtek számát 1 ml szuszpenzió.
Count a sejteket a lencse x10. Számla sejtek töltik a négy szett tizenhat kis négyzetek (minden sarkában a központi árnyékolt terület). Gondoljunk csak a festett sejteket. Elosztjuk ezt a számot 4, megkapjuk az átlagos sejtszámot 1 mm 2. Mivel a magassága a kamera 0,1 mm, a konverziós tényező a hemocitométer van 104. Feltételezve, hogy a kapott érték 20 sejt per 1 mm 2. Ezután 20h104 egyenlő a cellák száma 1 ml sósav-színű tripánkék felfüggesztés és 2h20h104 száma egyenlő a sejtek 1 ml az eredeti szuszpenzió, azaz a. e. a koncentrációja az élő sejtek a kezdeti szuszpenziót 4x10 5 sejt 1 ml.
Az egyik előnye a sejttenyészet mint más tárgyak tanulmányi számára a hosszú távú nyomon követése az életfunkciók sejtek, az állam az egyén sejtorganellumoké, a lezajló folyamatok a sejtek, hogy rögzítse a kultúra állapotát figyelembe véve mennyiségi és minőségi paramétereit.
Erre a célra, módszerek is alkalmazhatók sejtek mikroszkópos (mind élettartam és rögzítése után) és a fényképezés.
Az első sejtek készült fénykép egy elektronmikroszkóp, készült 1945-ben Keith R. Porter, Albert Claude, és Ernest F. Fullamom.
Leggyakrabban, mielőtt megjegyzi a mikroszkóp festett sejteket.
Hasonlítsa össze a két kép az egysejtréteg nyert a laboratóriumban (PK sejtvonal).
Nehéz elhinni, hogy ők egy és ugyanaz a kultúra. Az a tény, hogy a sejtek vannak festve különböző festékekkel.
lila metilénkék színezék
Indigo nucleus sejteket és szerkezetek metilén lila.
Vannak még egyéb módszerek szelektív festése szerkezeti elemek a sejt. Íme néhány példa.
Foltos mitokondriumok tenyésztett fibroblasztok (festék Rodamin123. Fluoreszkáló felvételek. Douglas Wallace, az Emory University, Atlanta)
Festett endoplazmatikus retikulum. Fluoreszkáló mikrokamera tenyésztett emlős sejtek festettük kötődő antitestek fehérjék az EPR. Hugh Pelham
A emlős sejt. Compliance a celluláris lokalizációját közötti mitokondriumok
(Bal, festék Rodamin123: vitális festéssel, fénymikroszkóp)
és mikrotubulusok (jobbra; immunoflyuoristsentnaya mikrokamera fixálás után; sejt színes fluoreszcens antitestek mikrotubulus Lan Bo Chen.).
A fix festett (Coomassie kék) cellában. Szelektív festése citoszkeletális fehérjék. Colin Smith.
Fibroblaszt. Mikrotubulusok (zöld, festett antitubiiin) interfázisban. Nucleus (kék-zöld) színű fluoreszcens festékkel a DNS-t. Nancy L. Kedersha.
Vannak módszerek vitális festéssel sejtek megkülönböztetésére élő és az elpusztult sejteket. Egyes cégek erre a célra termelnek speciális készletek.
Például az ilyen vizsgálatok hez cég Molecular Probes Europe BV.
PTK2 festett sejtek élő / EukoLight életképességet Kit, míg az elhalt sejteket vörös színűek, és az élő - zöld.
A szarvasmarha sperma festett sejtek élő / halott FertiLight Sherm Viability Kit. Élő zöld sejtekben.