DNS klónozása in vivo - titokzatos tudomány - Kiadó - a rejtélyt az ismeretlen

Vannak két megközelítés a DNS klónozását. Az első megközelítés magában foglalja a bakteriális vagy élesztősejtek többszörösen vezetünk idegen DNS-t. A második módszer egy DNS in vitro amplifikálás.

DNS klónozása in vivo

Mikroorganizmusok segítségével lehet létrehozni kétféle DNS könyvtárak: genomi klonális.

A genomi könyvtárból. Ha a szervezet genomjába vágni, illessze be egy plazmid vagy virális vektor, és bejuttatjuk egy sejtbe, tárolható ebben a formában. Amikor vágás a plazmid vagy fág DNS valószínűségét egészében és változatlan darab a genom elég magas.

Ez a módszer a termelő genomi könyvtár úgynevezett „shotgun szekvenálás”, hiszen ebben az esetben a gén tartalmazza az egyes töredékek.

Alapelvei létrehozása plazmid és virális vektorok átfogó, ezért tartjuk őket a példa a plazmid. Meg kell jegyezni, hogy mivel a vírus-DNS jobb használni DNS fágok, mert van egy nagyobb kapacitású és lehetővé teszi, hogy helyezze be a nagyobb darabokat a genomban.
Tisztított cirkuláris DNS-molekula, kezeljük egy restrikciós enzimmel, így lineáris DNS-t. A celluláris DNS-t kezelünk az ugyanazzal a restrikciós enzimmel, plazmidot adunk, ligázt adunk hozzá. Az így kapott rekombináns plazmid DNS-t, amelyet be lehet vezetni baktérium- vagy élesztősejtek. A plazmid szaporodik, így sok példányban. Számos plazmid hordoz egy gént antibiotikum-rezisztencia, és ha a rekombináns plazmidot egy olyan gén a sejteket könnyen azonosítható nő a közegben egy antibiotikum.
Mindegyik kolónia utóda vagy klónja egyetlen sejt. Tartalmazó plazmidokat egyetlen telepet klón genom DNS és plazmidok aggregált lehet nevezni genomi DNS-könyvtárat. A hátránya ennek a módszernek, hogy a DNS fragmentumokat állítunk elő nagy mennyiségben. Vágás esetén genomiális DNS-t határozzuk meg, így csak egy része a fragmensek teljes géneket. Egyes fragmenseket csupán egy részét tartalmazhatja egy gén vagy intronszekvenciákat.

cDNS-könyvtár. Készítése cDNS-szintézis kezdődik RNS-templát alapján reverz transzkriptáz komplementer DNS-szál. Ezután létre az alapvető feltételeket elpusztítani RNS-szál nukleotidjainak, majd a DNS-polimeráz szintetizál egy komplementer DNS-szálat. Ez képezi egy olyan DNS-fragmentumot tompa végű. Az ilyen DNS-t plazmidba inszertáltuk, és bevezetjük egy bakteriális sejt. Ha a plazmidot amplifikációs generált komplementer másolata a DNS-klón.

Előnyök DNS klónozására genomiális DNS klónozására, hogy egy olyan fehérjét kódol, a nukleotid szekvencia a gén nem megszakadt.
A gének eukarióták tartalmaznak intronokat, amelyek el kell távolítani a transkriptnoy RNS konvertálása előtt egy mátrixba, majd splicing. A bakteriális sejtek nem tudja elvégezni ilyen módosítást a képződő RNS transzkripcióját az eukarióta sejtek gén. Ezért, ha folytat fehérje készítmény expressziójával egy klónozott gén, akkor jobb, hogy egy cDNS-könyvtár alapján készített hírvivő RNS.

A genomiális könyvtárak, DNS klónozását in vivo

Miután a DNS-t térhálósított in vitro, meg kell lemásolni, azaz klón. Cél: így több példányban a kívánt géneket. Klónozásához kis DNS fragmensek vagy plazmidok, fág DNS-t a nagy - kozmidok és mesterséges kromoszómák.

Vannak két megközelítés a dezoxiribonukleinsav klónozására:

1) a használata bakteriális vagy élesztősejtek, hogy szaporodnak vezetünk idegen DNS-t.

2) amplifikáció DNS in vitro.

Mikroorganizmusok segítségével lehet létrehozni kétféle DNS könyvtárak: genomi klonális.

Genom könyvtár - gyűjteménye DNS-klónok, beleértve az összes fragmenseket tartozó genom a faj. E. Gene bank továbbra is hívják egy sor klónozott genom fragmensek. Ha a szervezet genomjába vágni, illessze be egy plazmid vagy virális vektor, és bejuttatjuk egy sejtbe, tárolható ebben a formában. Amikor vágás a plazmid vagy fág DNS valószínűségét egészében és változatlan darab a genom elég magas.

Ez a módszer a termelő genomi könyvtár úgynevezett „shotgun szekvenálás”, hiszen ebben az esetben a gén tartalmazza az egyes töredékek.

Alapelvei létrehozása plazmid és virális vektorok átfogó, ezért tartjuk őket a példa a plazmid. A vírus-DNS jobb használni DNS fágok, mert van egy nagyobb kapacitású és lehetővé teszi, hogy helyezze be a nagyobb darabokat a genomban.

Ahhoz, hogy hozzon létre egy génbank Bíróság:

1) izoláljuk a teljes genomiális DNS-t

2) DNS-fragmentációját restrikciós enzimekkel vagy ultrahanggal

3) Tisztított cirkuláris DNS-molekula kezeljük ugyanazzal a restrikciós enzimmel, így lineáris DNS-t. Celluláris DNS-t adunk a plazmid jelenlétében ligázok. Az így kapott rekombináns plazmid DNS-t

4) rekDNK be lehet vezetni baktérium- vagy élesztősejtek, ahol a plazmid replikálódik alkotnak sok másolatot.

5) Klónozás A baktériumok: Minden egyes kolóniát keletkezett sejtek egy klón egyetlen sejt vagy utódja. Tartalmazó plazmidokat egyetlen telepet klón genom DNS és plazmidok meghatározott formák egy genomi DNS-könyvtárat.

Hiányosság. DNS-fragment keletkezik nagy mennyiségben. Vágás esetén genomiális DNS-t határozzuk meg, így csak egy része a fragmensek teljes géneket. Egyes fragmenseket csupán egy részét tartalmazhatja egy gén vagy intronszekvenciákat.

Előny: génbank tárolható és használható korlátlan ideig.

-forrás anyag tanulmányozására szerkezetét, funkcióját és szabályozását az egyes gének, fehérjék szerkezete és működése

-megőrzését, a génállomány veszélyeztetett fajok

Hasonló gyűjtemények származó egyes kromoszómák vagy azok egy részét, az úgynevezett kromoszomális könyvtárakban.

DNS-t klónozunk. Szakaszai DNS klónozó. A restrikciós enzimeket. Korlátozást. Sunk.

DNS klónozása in vivo magában foglalja a 6 szakaszokban:
1) DNS-t nyerünk fragmentumokat, beleértve a géneket, vagy azok részei egy restrikciós enzimmel;
2) rekombináció a fragmensek
3) behelyezése a DNS-fragmenst egy vektorba;
4) transzformációs vektorral a gazdaszervezet;
5) Átvizsgálás a rekombináns vektor
6) klónok kiválasztása az érdeke, hogy a kutatók.

Néhány restrikciós enzim, valamint a nukleotid szekvencia felismerik, és restrikciós hasítóhelyek ezen szekvenciák

A restrikciós enzimeket. Korlátozást. Sunk.

Minden humán kromoszóma, csak egy folytonos DNS-szálat. Ez tele van nehezen illeszkednek a kromoszómán. Manipulált DNS-molekula, ez a hossz gyakorlatilag lehetetlen.

Ezért, a megnyitása a 70-es években a XX században. speciális bakteriális enzimek. vágni a DNS fragmensekre, ez nagyon hasznos. Enzimeket restrikciós enzimeknek hívják, vagy endonukleázzal.

A baktériumok, ezek az enzimek használják, hogy megvédje behatolása ellen idegen DNS sejtbe. Általában a restrikciós enzim felismerő az úgynevezett palindrom szekvencia megfigyelt nukleotidok a két DNS-szál és a következőkből állnak 4-6 nukleotid.

Példák több restrikciós endonukleázok táblázatban mutatjuk be.

A genomiális könyvtárak, DNS klónozását in vivo.

Miután a DNS-t térhálósított in vitro, meg kell szaporítható, azaz klón. Célkitűzés: Ahhoz, hogy egy példányt számos gén akar. Klónozására kis DNS fragmensek használni a plazmid vagy fág DNS-t a nagy - kozmidok és mesterséges kromoszómák.

Vannak két megközelítés a dezoxiribonukleinsav klónozására:

1) Bevezetés A bakteriális vagy élesztősejtek szaporítására a bejuttatott idegen DNS.

2) amplifikáció DNS in vitro.

Mikroorganizmusok felhasználásával, lehetséges, hogy két típusú DNS könyvtárak: genomi klonális.

Genom könyvtár - gyűjteménye DNS-klónok, beleértve az összes darabokat genomja tartalmazza az a faj. E. Gene bank továbbra is hívják egy sor klónozott genom fragmensek. Ha a genom bármely szervezet, hogy csökkentsék, belökték plazmid vagy virális vektor, és bevezetni a sejtbe, ebben a formában, meg lehet menteni. Amikor vágás a plazmid vagy fág DNS elvesztésének a lehetőségét teljes genom és módosítatlan fragmensek elég magas.

Egy ilyen módszer megszerzése genomi könyvtár már az úgynevezett „shotgun szekvenálás”, mert a gén ebben az esetben jelentése külön darab.

Az alapelvek teremtés plazmid és virális vektorok közös mert hogy ki a példa a plazmid. A vírus-DNS jobb használni a fág DNS, mert van egy nagy kapacitású és lehetővé teszi, hogy helyezze be a nagyobb darabokat a genomban.

Ahhoz, hogy hozzon létre egy génbank szükséges:

1) izoláljuk a teljes genomiális DNS-t

2) DNS-fragmentációját restrikciós enzimekkel vagy ultrahanggal

3) Tisztított cirkuláris DNS-molekula kezeljük ugyanazzal a restrikciós enzimmel, így lineáris DNS-t. Celluláris DNS-t adunk a plazmid jelenlétében ligázok. Makarom így kapott rekombináns plazmid DNS-t

4) rekDNK be lehet vezetni baktérium- vagy élesztősejtek, ahol a plazmid replikálódik alkotnak sok másolatot.

5) Klónozás A mikrobák: bármely kolónia megjelent sejtek egy klón egyetlen sejt utódaiban. Tartalmazó plazmidokat egyetlen telepet klón genom DNS és plazmidok összessége formák genomi DNS-könyvtárat.

Hiánya: DNS darab készült korlátlan mennyiségben. Vágás a genomiális DNS-t határozza meg a helyzet, mert csak egy töredéke az ilyen fragmensek tartalmazzák a géneket. Egyes darabok csak egy részét tartalmazzák a gén vagy az intron szekvenciákat.

Előny: génbank korlátlanul tárolható és használható hosszú ideig.

-forrás anyag tanulmányozására szerkezetét, funkcióját és szabályozását az egyes gének, fehérjék szerkezete és működése

-megőrzését, a génállomány veszélyeztetett fajok

Az ilyen gyűjtemény szerzett személyes kromoszómák vagy azok részeit nevezik kromoszomális könyvtárakban.

Talán lesz érdekelt a munka kapcsolódik: genomi könyvtár DNS klónozása in vivo.

Open Source Content Management

Írás és dönt bármilyen témáról Mikrobiológiai és kérdések! Kivitelezés a legrövidebb idő alatt egy kellemes áron! Töltse ki az alábbi űrlapot, és kap választ 15 percen belül.

Klónozása gén egy olyan eljárás, beleértve a szelekció és amplifikáció specifikus gének a befogadó sejtekben, pro- vagy eukarióta. Hírvivő RNS megjelent az azonos típusú sejtek a szervezetben, távolítsa el a DNS-másolatot. amelyeket azután be a recipiens sejtek és amplifikáljuk. DNS klónozása in vivo magában foglalja a 4 szakaszból áll:

4) transzformációs vektorral a gazdaszervezet;

5) Átvizsgálás a rekombináns vektor

6) klónok kiválasztása az érdeke, hogy a kutatók.

Befogadó sejtek - sejtek kiválasztott gén-klónozás céljára lehetnek mind pro-, mind eukarióta.

mRNS-t izoláltunk a sejtekből vagy szövetekből, amelyben a gén expresszálódik.

A DNS szintézise - enzim hajtjuk másolatait RNS-függő DNS-polimeráz. az e

enzim csatlakozott igényel egy rövid egyszálú DNS primer; erre a célra, mint a szabály, hogy az oligo. A mag spontán módon kettős szálú DNS komplex egy szegmens poli.

Depolimerizáció eredeti RNS-lánc által végzett lúgos hidrolízissel. DNS-lánc

rezisztens egy lúggal, és az RNS-t teljesen depolimerizált. Az így kapott DNS-t egyszálú.

Dupla szálú cDNS-t készítettünk kitöltésével-VH cDNS kettős szálú formában, által végzett DNS-polimeráz enzim I. ilyen cDNS lehet a vektorba beiktatva.

Két fő típusú vektorok, bakteriális plazmidok és bakteriofágok.

Plazmid - egy extrakromoszómális sejtek előforduló alkotó elemek zárt gyűrű molekula dsDNS. Ahhoz, hogy a cDNS-nek a plazmidba, a plazmidot zárt gyűrűt kell „nyitott”. Ahhoz, hogy ezt a plazmidot vetjük alá restrikciós enzimmel.

Restrikciós enzimes - vágások dsDNS specifikus nukleotid-szekvenciák ismert restrikciós helyeket.

A térhálósítás - olyan eljárás, amelynek az idegen DNS integrálódik között - ezt az eljárást, amelynek szükségességét annak köszönhető, hogy az a tény, hogy a kezdeti cDNS előállítására számos különböző mRNS-t és csak egy része a plazmid hordozza a kívánt gén számunkra.

Erősítés végzi a tény, hogy egy bakteriális sejt képes szintetizálni több példányban a plazmid érdekes számunkra, valamint a megszerzett nagyszámú sejt ezen plazmidokkal. Izolálás és tisztítás után a plazmidot kezeljük a megfelelő restrikciós enzimmel, amelyet a vágásra épített egy példányát a kívánt gén. Az amplifikált gént így felhasználható a további kísérletekben a géntechnológia.

Forrás: www.biotechnolog.ru, studopedia.ru, dommedika.com, reftrend.ru, biologymic.ru