Virology és biotechnológia (állatgyógyászati) - Mikrobiológia és virológia

Extrák. anyagok

Ápolják a vírus csak akkor lehetséges, az élő sejtekben. Erre a célra bármely biológiai rendszer: állati szervezetek, csirke embrió sejttenyészetben. Korábban a kezdeti fejlődési szakaszban az virológia széles körben használják erre a célra a laboratóriumi állatokon organizmusok (nyulak, tengerimalacok, fehér egerek és patkányok, aranyhörcsög), és gyakran - természetesen fogékony érzékenyek egy adott állati és madár-vírus (csirke, galambok, sertések, kutyák, macskák stb.) Amikor kiválasztja a laboratóriumi állatokat kell felelniük az alábbi követelményeknek: - az állatokat egészségeseknek kell lenniük. Ismét felvették a vivárium tartalmaznia karanténban (14 nap egerekben és patkányokban, a fennmaradó - 21 nap). Hogy megszüntesse látens (rejtett) vírusos fertőzések, így például ectromeliája fehér egerek, vírusos tüdőgyulladás, neuroinfection, állati vezérlési eljárást végeztünk ezeken hordozó szerek fertőzések. Ennek lényege abban áll, hogy a készítmény egy szuszpenzió holttestet erre a célra állatokat alkalmaztunk annak akvárium;
- állatok érzékenynek kell lennie a vírus;
- Az állat korától nagy jelentősége van: a leginkább fogékonyak a fiatalok és az újszülöttek, de néhány esetben, hogy azonosítsa a legfényesebb a betegség klinikai tünetei a felnőtt állatok számára;
- állatokat kell lennie az azonos korú és testtömegétől; jobban alkalmas erre a lineáris állatok, azaz a eredményeként kapott beltenyésztés.

Válogatás fertőzés vírus tropizmusuk határozza meg az eljárás, azaz a. E. Az a képesség, hogy reprodukálni bizonyos típusú sejtek. Megkülönböztetni Neurotrop vírusok (veszettség vírus átveszi idegsejtek), dermotropnye (ugyanez a bőrsejteket - zoster vírus), pneumotropic (tüdő-sejtek), politrop (ugyanez a számos sejttípus) pantropikus (amelyet az egész teljesen sejtek). Ismerve a a vírus tropizmusát, az anyagot visszük be a szervek tartalmazó sejtek érzékenyek a vírus.

Vírus-tartalmú anyag lehet bevezetni különböző módszerekkel, minden esetben választották ki a legmegfelelőbb. Mielőtt megfertőző az injekció helyén óvatosan kezeljük 3% -os alkohol oldatot a jód, vystrigaya kabátot ha szükséges. Szubkután beoltott, felemeli a bőr redők a hátsó, lapocka, térd redők nyakát. Intradermális módszer abból áll, juttatunk be a vastagsága a felső réteg a bőr a talpi felületén a hátsó végtagok a távolodó irányban az ujjak a bokaízület. Néha használják dörzsölés egy spatulával, ecsettel vírust tartalmazó anyagot a megkarcolt a has bőrét, belső comb, láb, comb, vagy tollal tüsző földön maradt. Az izom a comb, mellkas intramuszkulárisan oltunk be. Gyakran előfordul, hogy egerekben, patkányokban alkalmazott intraperitoneális szennyeződés, rögzítéséről az állat fejjel lefelé. Intravénás fertőzött egereken, patkányokon a laterális farokvénába, tengerimalacok - közel a kardnyúlvány egy régióban, nyulak - a marginális vénájába a fül, a madarak - a hónaljban véna fontos, hogy meggátoljuk, hogy a vénába a fecskendő nem szerepeltek légbuborékok. Mielőtt intranazális inokulálása állatok (kivéve a nyulak), hogy elkerülje a tüsszögés és a fröcskölés a vírus-tartalmú anyagok teszik mély éteres érzéstelenítés. Intratserebrapnoe szennyeződés kevesebbet: fehér egerek, nyulak, tengerimalacok - a bőr átszúrását követően, és a koponya a régió a külső széle a szem aljzatok, patkányok - egy fúrt lyukat. Attól függően, hogy az adagolás módja és az állatfaj fertőző dózis térfogatát meghatározzuk. A fertőzött állatok regisztráció után beállított napi megfigyelés a megjelenés, viselkedés, a mobilitás, a táplálékfelvételt, és így. D. A halál néhány állat lehet tekinteni, mint a nem-specifikus az első napon.

A vírus jelenlétét az anyag jelzik három jellemzői: a betegség tünetei, kóros elváltozásokat és halált. Vegye figyelembe, hogy az adatok nem mindig tüneteket, ha fertőzött, és az ilyen részeket az úgynevezett „vak”. Például a vírust tartalmazott patológiai anyagot egy ló nem tudja egyszerűen reprodukálni először a szervezetben a fehér egerek. Ebben az esetben a felfüggesztés az anyag az első járat elvégzésére ismétlődő, néha többször is megfertőző állatok ugyanazon faj.
Vírusok, melyek felderítése és szelekcióval természetesen fogékony állatok, nem igényel előzetes alkalmazkodás és megmutatkoznak a biológiai vizsgálati jelzések az első járat.
A megjelenése látható változásokat állapotát és működését a test után a kísérleti fertőzés tekinthető közvetett bizonyított virális replikáció és azt jelzi, hogy a vizsgált szerv vírust tartalmazott. Figyelembe véve a időtartama Az inkubációs periódus, amely jellemző egy adott betegség. Gyakran a betegség végződik halállal, ami szintén a jele a virális replikáció a szervezetben. A megnyitó a látható változások színe, mérete, alakja, konzisztenciája a szervek és szövetek is rámutatnak, hogy a replikáció a vírus a szervezetben. Előállítva egy állati vírus-tartalmú anyagot reagálni hinni vírusizolálás. Hogy meghatározzák a konkrét tartozék a vírus kell azonosítani szerológiai vizsgálatokat. Így az anyag ismeretlen előállított antigén a boncolás során a fertőzött állat.

Az vírustiterszint megértse kifejezése koncentrációja az anyagban. A vírus titerét - ez a vírus mennyiségét az egység által tartalmazott anyag mennyisége. A virológiai munka kísérleti fertőzés vagy a termelési és értékelése vírusellenes aktivitás és diagnosztikai készítmények gyakran kell meghatározni a vírus mennyiségét az adott anyag. A vírus mennyiségét egységekben fejezzük ki a cselekvés vagy aktivitási egység.

És a fertőző vírusok hemagglutinációs aktivitás. Ennélfogva, az egység a vírus mennyisége fertőzések és hemagglutinációs. A gyakorlatban három, különböző mennyiségű vírust egységek:
1. Fertőző egységek a helyi károkat okozott vírusok és értékelni, mint egy egyszeri hatás.
2. Fertőző egységek 50% -át vírusok az érzékeny élő tárgyak mért statikailag.
3. hemagglutinációs egység.

A helyi romlás vírusok által okozott, a legismertebb plakkok (szigetekben halott, megfestett sejteket egy réteg festett nappali) a fertőzött sejttenyészetekben, tele agar festék neytralrot és pockmarks (nekrotikus csomók) a HAO csirke embriókat fertőzött himlő és más vírusok .
A vírus mennyiségét ebben az esetben lehet mérni, illetve a blyashkoobrazuyushih egység (pfu) és ospoobrazuyuschih egységek (OOE): = 1 pfu dózist vírus okozta a kialakulása egy plakk; OOE = 1 adag vírus, amely miatt az egyik képződését pockmarks. Meghatározási módszere a vírus titer pfu (OOE) a következő:
1. Pontosan adagolt és szigorúan azonos térfogatú vírus-tartalmú anyag vizsgált megfertőzni több sejttenyészetek lombikokban, vagy csirkeembriókból Hao.
2. Count számú kialakult plakkok mindegyike matrac vagy minden egyes embrió csirke pocks.
3. Számítsuk ki a számtani átlagos számát, amely egyenlő a számát PFU vírus OOE vagy fertőző dózis a vírus-tartalmú anyag.
4. A virális titer (T) képlettel számítottuk ki:
T = számtani közép plakkok számát (pocks) / térfogat fertőzés dózis x hígítási vírus-tartalmú anyag.
Úgy véljük, hogy a bank adnak arra, hogy a plakkok és pockmarks, ha ezek száma nem nagyobb, mint 50 a matrac vagy Hao. Néha, abban az esetben egy nagy koncentrációban a vírus az anyagban plakkok sejttenyészetben vagy pockmarks Hao lehet egyesíteni, és nem lehet számolni. Ilyen esetekben, készítsen több tízszeres hígítású vizsgálandó anyagot és mindegyik hígításból beoltunk azonos dózis egyenlő csoportok sejtek vagy tenyészetek csirke embriókat, majd kiszámítjuk a számtani átlaga plakkok száma vagy pocks minden egyes hígítás. A vírus titer ebben az esetben úgy kell kiszámítani, egy bonyolult képlet:
T = teljes száma aritmetikai plakkok (hámlás) minden hígítás / v fertőző dózis x mennyiségű hígításait vírust tartalmazó anyagot
Módszer a vírusok titrálás pfu biztosítja a legmegbízhatóbb adatokat a koncentráció a vírust, de találkozik technikai nehézségek számolással plakkok. Ami a poloska, használatuk korlátozott, hogy viszonylag kevés a vírusok képesek alkotni csomók Hao csirke embriókat.

Ez a módszer több egyetemes. A vírus mennyiségét (vírustitert) az így mért 50% -os hatásos dózist - ED50.
1 ED50 = adag vírus, amely okozhat a fertőző hatást 50% A beoltott vizsgálati tárgyakat.
Minden egyes kiválasztott vírus érzékeny a vizsgálati tárgy - laboratóriumi állatok (rendszerint fehér egerek), embrionált tyúktojásokban vagy sejttenyészet. A fertőző vírus hatást vagy hatásokat a különböző vizsgálati rendszerek megnyilvánulhatnak halált, a klinikai tünetek és a változások pathoanatomical citopátiás hatást. A laboratóriumi állatok és csirke embriók hatása a vírus becslések szerint a halálos és fertőző dózis:
1 LD50 - a dózis a vírus, amely 50% -át elpusztítja laboratóriumi állatok;
I ELD50 - a dózis a vírus, amely 50% -át elpusztítja csirkeembriókból;
1 ID50 - a dózis vírus okozza a klinikai tünetek vagy a patológiás változásokat 50% fertőzött laboratóriumi állatok;
EID50 1 - egy adag a vírus okozza a patológiás változásokat 50% fertőzött csirke embriókból.
A sejttenyészet hatása a vírus értékeljük citopátiás hatás, vagy a hatás (CPE)
TSPD50 1 - egy adag a vírus okozó citopatikus hatás 50% a kémcsövek a fertőzött sejttenyészet.
Száma ED50 (LD50 ELD50, ID50, és TSPD50 EID50) vírus egységben foglalt térfogatú vírus-tartalmú anyag kifejeződése titer a vírus ebben az anyagban. Így a rögzítés T = 103,48 TSPD50 / 0,1 ml azt jelenti, hogy minden egyes 0,1 ml vírus-tartalmú anyagot tartalmazza 103,48 dózisban (3020), amelyek mindegyike képes indukálni egy citopatikus hatás 50% kémcsövek a kultúra sejtek.

Egyes vírusok képesek bizonyos feltételek mellett agglutináljanak vörösvértesteket az egyes fajok. A titer Ezeknek a vírusoknak is kifejezhető gemagglyutiiiruyuschih (Gaya).
Gai = 1 adag vírus, amely agglutinálja 50% az eritrociták szereplő ugyanaz, mint a vírus, az összeg 1% mosott eritrocitát.
Meghatározására szolgáló módszerek a vírus titer hemagglutináció műveletek a következők:
1) előállítunk egy 1% mosott eritrocitát egy állatfaj;
2) előállítására, egy sor egymást követő 2-szeres hígítású vírus-tartalmú anyag a vizsgálati plexiüveg lemezeket azonos térfogatú;
3) minden hígítási vírust tartalmazó anyagot adunk egy 1% mosott eritrocitát ugyanabban a mennyiségben;
4) az elegyet állandó rögzített időben egy bizonyos hőmérséklet és értékelni gemagglyutiiatsii intenzitást minden egyes rezervoárba (cső) a keresztezésekben. Ez legnagyobb hígítása, vírust tartalmazó anyagot, amellyel agglutinálja vörösvértestek 50% (nem kevesebb, mint két keresztek), tartalmaz 1 Gai.
A vírus titer növelni kell sok idő, hogy hányszor az anyagot hígítjuk, hogy 1 Gai. Ha a legnagyobb hígítás, amely hemagglutinációs két kereszt 1: 128, ez azt jelenti, hogy a vírus mennyiségét titrálással, hígított 128-szor, tartalmaz 1 Gai. Ebben az esetben, a vírus titer a hígítatlan anyag 128 Gai.

Nevezett fehérjék termelt antitesteket a szervezetben a meleg vérű állat, válaszul a parenterális adagolás a makromolekuláris anyagok jelei genetikai heterológ a szervezetre. Olyan anyagok, amelyek képződnek antitestek adagolását nevezzük antigének. A vírusok túlnyomórészt antigének. Antitestek reagálni képes az antigénnel, amelyre válaszként előállítottuk őket (antitest specifitás) és semlegesíti annak biológiai aktivitását. Így, az antitestek védik a szervezetet a fertőző ágensek elleni, ez a biológiai jelentőségét azok kialakulását. Az antitestek kölcsönhatásba léphet homológ antigének nem csak in vivo, de in vitro.

HAI elv áll az a tény, hogy in vitro kevert azonos térfogatú szérumot és a vírus szuszpenzió és az expozíció után annak meghatározására, hogy a vírus a keveréket tartósított hozzáadásával eritrocita-szuszpenziót. Agglutinációját eritrociták jelzi a vírus jelenlétét a keverékben. A hiánya hemagglutinációs azt jelenti, hogy a vírus antitestek semlegesítik, és így elvesztette a képességét, hogy agglutinálja a vörös vérsejteket.
De antitestek antigénekkel lépnek kölcsönhatásba szigorúan meghatározva mennyiségi arányokat. Ezért, hogy egy bizonyos mennyiségű vírus nem volt alkalmas hemagglutináló kapacitást igényel bizonyos minimális antitestek, valamint az egyik a HAI komponensek mindig ismeretlen, szükséges, hogy a reakciót egy sorozat kémcsőbe különböző dózisaival azonos antitestek, és a dózist a vírus, vagy fordítva. Ezt úgy érjük el, hogy azok figyelembe vagy különböző hígítású szérumot és ugyanolyan hígításban vírus vagy különböző hígítású vírus és ugyanaz szérumhígítási.
HIT a következő feladatokat látja el:
- meghatározzák a titere a vírus elleni antitestek szérumban gemagtlyutiniruyuschemu;
- gemagglyutiniruyushy azonosítani egy ismeretlen vírus az ismert szérum;
- hogy olyan mértékű antigén rokonság a két vírus.
Előnyei HIT: egyszerű technika, gyors, nem igényel steril munka, specificitás, olcsó. Hátrány: HI csak akkor lehetséges, gemagglyutiniruyushimi vírusok.

Az elv a titrálásával antitestek HIT a következő:
- előállítására több egymást követő (rendszerint 2-szeres) a szérumból azonos térfogatú (tálban 0,25 vagy 0,2 ml);
- t adtunk az azonos térfogatú a homológ vírussal titere 4 Gai;
- tartjuk az elegyet egy bizonyos ideig egy bizonyos hőmérséklet (a Newcastle-betegség-vírus 40-60 perc, szobahőmérsékleten);
- valamennyi keverékben adtunk azonos térfogatú 1% -os szuszpenziójának mosott vörösvérsejtek;
- expozíció után értékeljük hemagglutinációs az egyes keverékekben keresztezésekben.
A reakció során olyan, a kontroll szérum, vírus és a vörösvértestek.
A legmagasabb hígítás szérum, hogy még teljesen gátolja gemagglyutinaiiyu. Ez hozott jeleként antitest titer a szérumban.