Replikációja nukleinsavak - studopediya
Az elsődleges funkciója a DNS, hogy képes önmagát duplájára (replikáció). Replikáció - egy nagyon pontos mechanizmus, szinte nincs hibákat. A DNS-t önmagában (bizonyos vírusok - RNS) kódolt információk a szerkezetét enzimek foglalkozó megkétszereződését nukleinsavak, a szintézis az új nukleotid - az épület adatbázis-replikáció, kijavítása replikációs hibákat, valamint a DNS-károsodás javításának által okozott különböző tényezők. Végül a DNS-szerkezet maga, vagyis az a két lánc szerkezetében, előfeltétele eljárás elősegítése másolás, mint a jelen esetben, az egyes láncok szolgálhat mátrix szintéziséhez új DNS-molekulák. Ez a feltételezés van kifejezve, James Watson és Frensis Krik 1953-ban, és ez kapott kísérleti igazolását. Az ilyen DNS-másolás mechanizmust, amikor az egyes áramkör funkciója van a sablon és az újonnan szintetizált molekulák hibridet (amely egy régi és egy új lánc), szemi-konzervatív.
Emellett semiconservative felajánlották két másik replikációs modellek: konzervatív és diszperziós. A jellemzői e DNS-replikáció típusok az alábbiak. Szerint diszperziós modell szülői DNS-hélix van törve megduplázásával minden fél fordulat a több fragmentáció és szintézisét az új láncok fordul elő a fragmentumokat (ábra. 1.9). Szerint a konzervatív modell a DNS-spirál lazításra nem történik egyáltalán, és ez szolgál egy sablont a két új áramkör, ami a szülő spirál áll teljes egészében a régi, és teljes tulajdonú leányvállalata - az új anyag. Bizonyítás valóságban semiconservative DNS replikációs mechanizmust Meselson, Steel 1958, ultracentrifugálás kísérletek jelzett bakteriális DNS-t.
Ezek lényege, kísérletek a következő volt: E. coli DNS-t jelölt radioizotóp 15 N, majd hagyjuk, hogy valóra egy forduló DNS-replikációt, növesztjük a sejteket,
50 perc tápközegben tartalmazó normál nitrogénizotóp - 14 N. Az izolált DNS-t a sejtek ultracentrifugáltuk cézium-klorid sűrűség-gradiens. Ilyen molekulák előállítása CsCI centrifugálással sűrűséggradiens csövet, és más anyagok molekuláit, hogy vannak elosztva gradiens sűrűségük alapján. DNS E. coli, növesztjük olyan tápközegen, amely 15 N, sűrűsége 1,724 g / cm 3, míg a DNS növekvő sejtek a szokásos táptalajon izotóppal 14 N, sűrűsége 1,710 g / cm 3. így a keveréket, a két típusú DNS-t könnyen centrifugálással elválasztjuk a sűrűség. Lokalizációja DNS egy kémcsőben a CsCl-gradiens lehet UV abszorpcióval határozzuk meg (DNS elnyeli a sugárzást egy 260 nm hullámhosszon). Így, DNS detektálható in vitro formájában „csíkok” - „könnyű” a felső széle a cső, a „nehéz” - közelebb van az alsó. Ebben a kísérletben, az in vitro gradienssel cézium-klorid képződött csak egy, az átlagos „gravitációs” sávban, amelynek a helyzete megfelel a hibrid DNS két nitrogénatomot tartalmazó izotóp - 15 N és 14 N Ez a tény zárja ki annak lehetőségét végrehajtási csak egy DNS-replikáció modell -konservativnoy. Választhatunk a fennmaradó két modell replikációs Meselson, Steel hagyjuk baktériumok, amelynek DNS egyaránt tartalmazott izotópokat, hogy még egy részlege a tápközegben a 14 N. Ezután a DNS-t ismét ultracentrifugáltuk. Ebben az időben, az in vitro DNS képződik két sáv - a „könnyű”, és az átlagos „gravitációs”, amely megerősíti a érvényességét semiconservative DNS replikáció mechanizmusa.
Tehát, mind tanult által most, hogy a replikációs nukleinsavak csökken a félig konzervatív mechanizmus, amellyel minden kör után a replikáció, egy szál mind a két lánya molekulák a szülő, azaz konzervatív, és a másik - .. szintetizálva elölről. Replication az egy- és kettős szálú nukleinsav, ami a genom különböző organizmusok, alatt hajtjuk végre bizonyos törvényszerűségek a végrehajtását a különböző mechanizmusok, amelyek az alábbiakban tárgyaljuk. Gyakori, hogy ezeket a folyamatokat: 1) rész egy komplex enzimek, amelyek replikáció; 2) jelenlétében, három fő folyamat lépéseinek - elindítása, meghosszabbítása és terminációs; 3) megfelel a komplementaritás elvét az építőiparban az új láncok, ahol a minta (mátrix) szolgál a szülő lánc; 4) Nagy pontosság a folyamatot; 5) lehetősége van kijavítani a replikációs hibákat lektorálás.
Replication kettős-szálú DNS-t. Dupla szálú DNS-t alkotják a genom összes celluláris organizmusok - és prokarióták és eukarióták. Nos a DNS-replikáció vizsgáltuk tekintetében prokarióta sejtekben, különösen E. coli baktériumot. A kísérletek prokariótákban mutatták, hogy az olyan feltételekkel korlátozzák a fehérjeszintézist, a DNS-replikáció nem fordul elő, amelyből arra lehet következtetni, hogy ez a folyamat részvételét igényli fehérjék. Közelmúltban arra is rámutattak, hogy az érintett termékek több mint 10 gént a folyamat a DNS replikáció. Ez, elsősorban, a DNS-polimeráz. és topoizomeráz. heiikázzai ligázok. Egyre több bizonyíték támasztja alá a részvétel a folyamat a DNS-replikáció magasan szervezett multienzimkomplexet -replisomy. álló praymazny-primosome komplex, helikáz, Pol III-holoenzim és a giráz.
DNS polimeráz - amely kulcsenzim replikatív folyamatok ténylegesen elvégzi kapacitás polinukleotid láncok segítségével komplementaritás elve. A legalaposabban tanulmányozott DNS-polimeráz az E. coli. A sejteket a baktériumok találtunk három különböző típusú DNS-polimerázok (Pol-I, Pol-II és a Pol-III), amelyek különböznek elsősorban az arány a katalízis és a nukleáz aktivitása. DNS-polimeráz I (Pol-I) egy egyszeres polipeptid, amely körülbelül 1000 aminosavat tartalmaz. A E. coli sejteket, van körülbelül 400 molekula az enzim. Pol-I a következő tevékenységek: Polymerase - összekötő dezoxinukleotidokat komplementer a templát szálat egy szabad 3'-OH csoportot a primer abba az irányba, az 5'-, hogy a 3'-végén (5 „→ 3”) van kialakítva DNS-molekula; exonukleáz - hidrolízise foszfodiészter kötések (hasítása nukleotid) egyetlen DNS-szál vagy párosítatlan végén duplex DNS, mivel 3ў-end áramkör (3 '→ 5') és az 5'-végén a lánc (5 '→ 3'). Exonukieázaktivitás fontos szerepet játszanak a replikációt és a javító kromoszomális DNS az E. coli. 3 „→ 5 'exonukleáz aktivitás biztosít kontrollt minden egyes nukleotid hozzáadás és törlés hibás termesztés nukleotid láncot vége (lektorálás), és az 5” → 3' exonukleáz aktivitás eltávolítására használt dimereket és pirimidin-ribonukleotid-Okazaki fragmensek.
DNS-polimeráz II (Pol-II) van jelen a sejtekben az Escherichia coli lényegesen kevesebb példányban, és végrehajtja a polimeráz aktivitás sokkal lassabb, mint a Pol-I (csak 5% -át az aktivitás a DNS-polimeráz I). Ellentétben Pol-I, ez az enzim nincs 5 „→ 3 'exonukleáz aktivitással. A szerepe ennek a polimeráz replikációs nem teljesen tisztázott. Úgy véljük, hogy ez az enzim nem szükséges DNS-replikációhoz, de helyettesíti az egyes funkció Pol-I, ha sérült.
DNS polimeráz III (Pol-III) - a fő enzim felelős replikáció a kromoszomális DNS az E. coli. Minden sejt csak 10-20 molekulák ezen enzim, de fut mintegy 60-szor gyorsabb, DNS-polimeráz I. Ráadásul, Pol-III-nak nagyobb az affinitása a mátrixhoz, és biztosítja a magas hatásfok a másolást. Ezen enzim, valamint a Pol-II, nem inherens 5 „→ 3 'exonukleáz aktivitással. Ezért, replikáció az leszakadó áramkör Pol-I részvételét igényli előfordulnak eltávolítása RNS primerek az 5'-végén a Okazaki fragmensek.
Az eukarióta sejtekben, kiderült, nagyobb számú DNS-polimeráz, de azok funkcióit vizsgálják rosszabb.
topoizomeráz funkciója az, hogy megoldja a mechanikai és topológiai problémák folyamatban letekercselésének a kettős hélix a replikációs villa. Ezek az enzimek megváltoztatják a mértékét szuperspirálosodási és kialakulásához vezet a „zsanér”, amely megteremti a feltételeket a folyamatos mozgását a replikációs villa. A különböző szervezetek azonosított topoizomeráz két fő típusa van: I. típusú topoizomeráz bekarcolt egyik a két lánc, ahol a végrész a kettős hélix tud fordulni intakt láncokat, majd egyesítése a levágott végét a lánc. Topoizomeráz II ami átmeneti szünetek mindkét komplementer szál módosítja a mértéke szuperspiráiosodási, majd csatlakoztassa a törött végeket.
Helikáz végzett kialakulását és a haladás mentén hélix DNS replikációs villa - kisodródás adagban molekulaláncok. Ezeket az enzimeket használják kisodródás láncok felszabaduló energiát az ATP hidrolízisével. Annak biztosítása érdekében, nagyobb sebességű letekerécséhez több helikázok együtt működnek egy második típusú fehérjék, amelyek kötődnek egyszálú szakaszok a molekula, és ezáltal stabilizálják letekercseljük duplex.
Végül, DNS-ligáz által katalizált folyamatokat újraegyesülés fragmensek DNS-szálak, részt vesz a kovalens kötések képződését (foszfodiészter hidak) között az 5'-P- és 3'-OH-csoportokat a szomszédos dezoxiribonukleotid. Ezek az enzimek használják az energiát, mint az energia-gazdag kötés által alkotott ATP hidrolízisével vagy GTP.
Nyúlás a DNS-replikáció. A szintézis az új DNS-szál végezzük elvének megfelelően a komplementaritás: szedett egyes termesztési nukleotid láncot, hogy komplementer legyen a megfelelő (szemben található) az eredeti nukleotid (mátrix) áramkör.
Mivel minden DNS-polimerázok hajtjuk nukleotidok polimerizációs eljárás csak egy irányban (5 „→ 3”) és a replikációs villa mentén mozog a DNS-t mindkét irányban folyamatosan szintetizált egyes területek csak az egyik szál, az úgynevezett vezető. A második (szemközti) szál szintetizálódik rövid fragmensek (Okazaki fragmensek) és az úgynevezett lemaradt (ábra. 1.10). Okazaki fragmenseket prokarióták tartalmaz körülbelül 1000 nukleotid, és eukariótákban - 100-200 nukleotid.
Továbbá polimerizációs láncok amely ellátja elsősorban a DNS-polimeráz III, a DNS-replikáció során a következő események történnek:
- vágás az RNS lánc primerek a vezető és a mind a Okazaki fragmensek. Ez a funkció elvégzi a Pol-I keresztül 5 „→ 3 'exonukleáz aktivitás;
- kitöltésével a „rések” maradt a vágás RNS primerek. Ez a munka is rendelkezik, DNS-polimeráz I, a szabad 3'-OH csoporttal szomszédos Okazaki-fragmens;
- csatlakozott a DNS-fragmenseket a leszakadó lánc DNS-ligáz enzimmel, amikor növekvő a 3'-hidroxil-végén minden Okazaki-fragmens eléri az 5'-végén egy szomszédos dezoxinukleotid molekularész hatékony DNS-ligázt, és kialakult a folyamatos leszakadó áramkört;
- korrekciós replikációs hibák - lektorálás. Ez a mechanizmus jellemző Pol-I, és a Pol-III és alapja a 3 „→ 5'-exonukleáz aktivitását. Ismeretes, hogy a DNS-polimeráz ellenőrzi a felvette nukleotid komplementaritás szabályozására feltételezett mérete az új bázispár aktív centrumában, a polimeráz aktivitása csak akkor aktiválódik, ha ez a kiegészítő készlet. Másrészt, minden újonnan beépített nukleotid is ellenőrizni betartását párjával az aktív oldalon az enzim. Ha a méret a keletkező bázispár nem felel meg a valódi (amikor a szemben lévő alsó nukleotid nem komplementer egymáshoz), keresztül a 3 „→ 5 'exonukleáz aktivitása az enzim vágások és egy nem komplementer nukleotid-kereséseket a csere érdekében. Egy további mechanizmus, amely csökkenti a replikációs hibák, DNS-javítás. Ennek eredményeként, a gyakorisága téves nukleotidok beépülését a kapott DNS szálat a replikáció rendkívül alacsony (10 -8 -10 -10).
Replikációs Terminatsiya. Amikor a kétirányú gyűrű genom replikációja (például E. coli-ban), replikációs villa találkozik a parttól 180 ° a pont a replikáció és replikációs ezen a ponton végződik. A gyűrű alakú DNS-ligáz csatlakozott az ülés helyét, és ezek kölcsönösen reteszelt, és a további ezek szétválaszthatok különálló genomok keresztül topoizomeráz II.
Ez az arány a DNS replikációt E. coli baktériumok mintegy 1500 bázispár másodpercenként. Így a teljes genomját Escherichia coli (4 x 10 6 par. N.) Replikált mintegy 40 perc alatt. Azonban E.coli sejtek osztódnak gyorsabb - 20 percenként, ami azt jelenti, hogy jelentősen növeli az eljárás megindításáról ugyanúgy fejti ki a kiindulási pont replikációs azonos sebességgel másolást. E. befejezése előtt az első fordulóban a genom replikációs ori helyén a második replikációs kör indítjuk. A mozgás sebessége a replikációs villa eukarióta sejtekben lényegesen alacsonyabb (10-100 bp másodpercenként), de a befejezése replikációs ésszerű időben biztosítja egyidejű iniciáció több pontot. Ennek eredményeként, a Drosophila kromoszómán, például, amely 6,5 * július 10 bp reprodukálni néhány perc alatt.
Általában replikációs minták azonosított prokarióták, szintén jellemző a legtöbb eukarióta genomok. A különbségek, elsősorban, jelenlétében több eukarióta replikációs iniciációs helyeket az egyes kromoszómán, eltérő prokarióták, mechanizmusok, hogy korrigálja a replikációs hibákat, valamint enzimatikus berendezése a replikációs folyamatban. Sematikus ábrázolása a ciklikus folyamat replikációs képező prokarióta genomok és plazmidok, és lineáris (eukarióta) genomok ábrán mutatjuk be. 1.11.
A lineáris DNS-letekerjük a láncok végzi forgó körül egymáshoz a lánc. A cirkuláris DNS letekerése és replikáció képződéséhez vezethet hasonló szerkezetet gyűrű egy belső hurok. Ez az úgynevezett theta-loop. mert a forma hasonlít a görög betű Q. Ezek a hurkok látható a autoradiografálása lemásolják bakteriális DNS végzett az első alkalom, hogy Cairns E. coli DNS-t. A fenti mechanizmus a kétirányú DNS replikációs a leggyakoribb, de nem az egyetlen. DNS fágok P22, 186, P2, és a T4-fág és L a későbbiekben a litikus ciklus replikált hordozója mechanizmust (típus gördülő kör). Ebben az esetben, egy kettős szálú, cirkuláris DNS bemetszést specifikus enzim egy egyetlen ilyen hely egy egyláncú (a kezdőpontját gördülő kör). A kapott bemetszés 5'-végén a lánc kapcsolódik egy enzim végzett a bemetszés. DNS-szintézis kezdődik az 5'-végen az elmozdulás az enzimmel kapcsolódó oldatban, amely lehetővé teszi a DNS-polimeráz, hogy csatolja nukleotidok az 3'-OH végéhez. Semiconservative replikáció fordul elő, amelyben az 5'-végén a törött lánc elmozdul, mint a szabad farok és annak minden hossza növekszik, miközben a mátrix szolgál, mint egy zárt áramkör sértetlen. Ez a replikálódó szerkezet (ábra. 1,12) nevezzük gyűrűt gördülő, mivel letekerhetjük a szabad egyszálú lánc kíséri a rotációs mátrix tengelye körül.
Ha ezt a mechanizmust alkalmazunk a kettős-szálú DNS-replikáció, a 5'-terminális farok szolgál templátként a szintézis kis DNS-fragmentumot, amely azonnal összevarrva DNS-ligázzal. Ennek eredményeként a növekvő farok után rövid időn belül kialakulása szerez egy kettős szálú szerkezetet. Nyúlás farka néha vezet
hogy teljes hossza többször hossza az eredeti körkörös molekulát. Egy ilyen replikációs módszerrel, például fág l. Amikor DNS csomagolást kapszid speciális területeken úgynevezett cos-oldalak és elválasztva a hossza a vírusgenom bemélyedések, aminek során a hosszú duplexek többször megismételjük fág DNS-fragmentumnak fragmensek megfelelő méretű érett DNS kimutatható virionokat bakteriofág l . Gördülő kör replikációt is jellemző a kialakulását a bakteriális kromoszómába másolási E.coli Hfr és F faktor +. továbbított konjugáció recipiens sejtbe.
Replication egyszálú DNS. A M13-fágok vagy fH174 amelyeknek a genomja mutatjuk érett egyetlen kör alakú DNS-replikáció végezzük orsókoszorút mechanizmus (ábra. 1.12). Ez akkor fordul elő a fertőzés későbbi fázisában, miután
infektív kettős szálú DNS-t transzformáljuk egy gyűrű alakú. Ebben az esetben, nincs replikációs hajtjuk 5'-végrészek, ellentétben a genomok a fág replikációs l (ábra. 1,12, poz. 5), úgy, hogy a replikációs termékek hosszú egyszálú DNS, folyamatos elválasztására a „gördülő roll” Ezek az áramkörök minden metszeni a replikációs origót és zárt gyűrűt alkotva, érett formáit csomagolt kapszid.