Meghatározása proteolitikus aktivitása tej alvadási gyógyszerek

Tej-véralvadási gyógyszerek mellett a tej-alvadási aktivitását, és a proteolitikus aktivitást fejtenek ki, azaz a a képesség, hogy hasítja a tejfehérje.

Mivel a akut hiány a sajtiparban természetes kimozin (oltóenzim) egyre szélesebb alkalmazását helyettesítő mikrobás és állati eredetű. Azonban nem minden termék sikeresen helyettesíti oltó. Készítmények, amelyek nagy proteolitikus aktivitással, okozhat mély kazein hidrolízise, ​​ami egy drasztikus csökkenéséhez minőségének sajt (a megjelenése keserűség). Ebben a tekintetben, amikor alkalmasságának megítélésében a gyógyszer, mint helyettesíti oltó kell vizsgálni, proteolitikus aktivitását.

A jellemzője az intézkedés az említett hatóanyag a kazein molekula szelektív támadás Távközlési fenilalanil-metionin a kazein, ami viszont azt eredményezi, hogy a felfedezés a visszamaradó foszforsav és kombinációk parakazeina molekulák vérrögképződés által Ca-hidak. Vázlatosan ez a következőképpen fejezhető ki (7. ábra):

További molekula lényegében nem hidrolizált kazein, amely biztosítja az ellenállást csomó, és továbbá, hogy a túrószemcséket. Grafikusan, ez a 8. ábrán látható.

Ebben az esetben, a görbe emelkedése 15 percen belül (1. görbe) mutatja a kialakulását GMP. Ezt követően hidrolízis gyakorlatilag hiányzik. Eltérés ettől a (2-es görbe) általában vezet zavarok vérrög kialakulása és érése sajt. Egy közötti távolság 1 és 2 görbe az úgynevezett intézkedés a nem specifikus proteolízis (ISP). Minél nagyobb ez az érték, annál nagyobb a kockázata a keserű, tisztátalan és más ízek a végtermékben.

7. ábra - reakcióvázlatban cselekvési oltós a kazein-molekula

8. ábra - Graph képződési reakcióidő kazein hidrolízis termékek

Ebben a papír, a feladat a teszt, hogy meghatározza, hogy alkalmasak a készítmény, mint a helyettesítő kiindulva oltós kazein hidrolízis intenzitása idővel.

A módszer elvét. Meghatározása oltóenzim és helyettesítő mikrobiális és állati eredetű alapján felhalmozott kazein hidrolízis termékek oldhatók 1,125 M triklór-ecetsav egy bizonyos időintervallum az a reakció kezdetétől.

Haladás. A fiolákat venni 2 ml kazein szubsztrát elő, és 5 percig inkubáltuk. 35? C-on Ezután Pipettázzunk 0,5 ml enzim-készítményt, egyidejű felvétel készítésére. A reakciót leállítjuk, miután 5, 10, 15, 20, 30, 40, 90 perc alatt úgy, hogy 5 ml 1,125 M TCA oldattal. A kapott elegyet keverjük, és hagyjuk állni 30 percig, ami után átszűrjük egy dupla hajtogatott szűrőn. Ezzel párhuzamosan a definíció határozza nulla és egyetlen mintán.

Nullára egy kémcsőben vesszük 2 ml szubsztrát-oldatot, 5 ml 1,125 M TCA-oldattal és 0,5 ml enzimkészítmény oldatot.

Az eredmény az üres ellentétes kihalás reagenseket. Ebből a célból, 5 ml 1,125 M TCA oldathoz 2,5 ml desztillált vízben, és leszűrtük ugyanolyan módon, mint abban az esetben a nulla tapasztalattal 30 perc után. A szűrletet meghatározott kazein hidrolízis termékek oldhatók 0,75 M TCA oldattal. Egy bizonyos mennyiségű a szűrletet (maximum 1 ml) vettük csövekbe oly módon, hogy a koncentráció a kapott kazein bomlástermékek során kolorimetria tartományban van 20 és 150, ezután azonos mennyiségű 0,75 M NaOH-oldatot (hogy megkapjuk a kívánt pH- reakció réz és fenolos reagensek) desztillált vizet adunk, hogy térfogata 2 ml, majd az összes szükséges reagens által biztosított Lowry módszerrel. Miután egy 45 perces expozíciós extinkciót 750 nm-en képest a vakminta értékét.

A kalibrációs görbét (20 - 200) arra szolgál, kazein Gammmarstenu (lásd Irányelvek végrehajtása Biokémia UIRS speciális diákok 1017 munka № 5 „meghatározása tejfehérje a Lowry módszerrel.”.). Feltételezzük, hogy a bomlástermékek kazein adni ugyanazt extinkciós változatlan formában a kazein.

Kísérletet háromszor megismételjük.

A számítás a kapott adatok

Proteolitikus aktivitást pokazyvat hány mg kazein fehérjét átvisszük egy oldható formáját enzim per milligramm a gyógyszer 35? C-on, pH = 6,6, egy bizonyos ideig. Kiszámítása a proteolitikus aktivitás (Ep) szerint hajtjuk végre, a következő képlet:

ahol: Er - proteolitikus aktivitását enzimkészítmény;

C - a koncentráció a enzimkészítmény, mg;

A - mennyiségű oldható kazein hidrolízis termékek idővel, mg

ahol: B - mennyisége kazein hidrolízis termékek mért megfelelő kipusztulás;

7.5 - minta térfogata (2 ml szubsztrát, 0,5 ml enzimkészítmény, 5 ml TCA oldat);

V - szám vett kolorimetriás oldatot ml.

Anyagok és reagensek. Kazein (lásd 1. függelék, 7. igénypont); Reagent A, B, C (lásd 1. függelék, 17. igénypont); Folin reagenst (lásd 1. függelék, 8. igénypont ..); enzimkészítmények; 1.125 M TCA oldatot; 0,75 M nátrium-hidroxid-oldattal.

Felszerelés. Hajtogatott szűrő; csövek; 1 pipetta és 2 ml skálaosztás 0,05 ml; 60 vagy FEC-FEC-56m.