Mátrixok szerinti DNS szekvenciálás a Sanger
Előállítása egyszálú templát DNS-t
megszerzi a készítmény DNS-molekulák számára ebben a folyamatban. Így, ha a DNS-szekvenálási módszer a kémiai degradáció volt szükség, hogy egy egyszálú vagy kettős szálú fragmenst hordozó azonos (homogén) végükkel csak jelzés, egy enzimes szekvenálási eljárás jelzetlen igényel DNS templát és a kívánatos egyszálú. Bár, a méltányossági, meg kell jegyezni, hogy a DNS-mátrix, hordozó bármilyen jel (beleértve a radioaktív), a legtöbb esetben nem lesz észrevehető hatással van a végső autoradiográfon a nagy különbség a nagyon méretű mátrix, és újonnan szintetizált egy megszűnése a DNS-lánc . Ami a DNS-templát, amelynek egyik vége hordozza biotin jelölést a molekulában, ebben az esetben lehetőség van arra, szorpciós a szilárd fázisban, például a mágneses részecskék sztreptavidinnel és tartja az úgynevezett szilárd fázisú szekvenálási. Amikor ez a kimenet biotinilált jelekkel a végső oldatban terminátort tartalmazó elegyet a komplementer lánc DNS már jelzett valahogy másképp, és adaptált alkalmazására egy szekvenáló gélen, nem is fordul elő.
Visszatérve felkészülhessenek mátrixok, azt kell mondani, hogy mivel bizonyos nehézségek megszerzése egyszálú származó kettős szálú DNS-fragmentumok, az első sikereket enzimatikus szekvenálás-Vania értek el a természetes egyszálú DNS, mint például bakteriofág és fH17 fl [Sanger et al. 1977a; 1973]. Jelentős erőfeszítésekre van szükség, hogy alkalmazza a kísérletezők, így egyszálú DNS-sablonokat alkalmas szekvenálás, enzimatikus módszerrel, első gátolt elterjedt ez a módszer, mert a szükséges időt, hogy megkapja őket, az egyik legfontosabb eleme a folyamatnak. Így a korai kísérletek DNS-szekvenálás azt javasolta, a klónozás az érdeklődés fragmens lambda bakteriofág, majd szétválasztás láncok [Davies 1982] egy nagyon hosszú ultracentrifugálással, sűrűséggradiens cézium-kloridot és poli (U, G), képeznek elég hosszú [Szybalski és mtsai. 1971]. Egy másik megszerzésének módja mátrixok szekvenálásra, szintén a szétválás áramkörök, de kromatográfia volt a módja klónozása DNS-fragmensek egy speciális vektorba rKN47, épített alapján a pBR322 plazmid, és tartalmaz egy poli (dA): poli (dT) duplex fragmens hossza körülbelül 100 bp [Hayashi, 1980]. Ez lehetővé tette denaturált plazmid DNS elég ahhoz, hogy végezzen hatékony elválasztását áramkörök klónozott inszertumok együtt vektorszekvenciák, amelyek közül az egyik kezében egy poli (dA) -, és a többi - poli (dT) oszlopon -uchastki oligo (dT) - és oligo ( dA) -cellulóz rendre.
Enzimkészítményt egyszálú DNS alkalmas szekvenálás, meglehetősen sikeresen végezzük exonukleáz III [Smith 1979]. Ebben az esetben, egy DNS-fragmenst elhasítottuk egy vagy két megfelelő restrikciós endonukleázokkal, és ennek eredményeként az ezt követő feldolgozása exonukleáz III történt egyidejű hasításával mindkét DNS-szál irányába 3 „→ 5” és az oktatás vagy két egyszálú fragmensek, amelyek nem hasítható további exonukleáz III, vagy struktúrák, a fennmaradó duplaszálú rész (abban az esetben tökéletlen emésztés). Mivel exonukleáz III lehasítja különböző nukleotidmonofosfaty egyenlőtlen sebességű [Linxweiler, Horz 1982], majd a teljes hidrolízist egy DNS-fragmens képződik, általában valamelyest eltérő méretű közötti egy egyszálú alfragmentumok alkotó mintegy fele az eredeti DNS-fragmensek mindegyike.
Bizonyított nagyon kényelmes előállítását egyszálú DNS-templátok után klónozó vektorokba alapuló fonalas fág M13 [Messing et al. 1981], amely elkötelezett számos eredeti cikkeket és vélemények [Sanger et al. 1980 Davies, 1982; Bankier, Barrell, 1983, 1988; Messing, Bankier 1988]. Ez a megközelítés tette gyakorlatilag használhatatlan módszerek röviden a fent leírt, és az egyszerűsége miatt drámaian növekedett a rendelkezésre állás, így a népszerűsége a módszer enzimhatású DNS-szekvenálás didezoksiter-minatorami.
Biológia egyszálú fonalas fág f1 olyan, hogy az életciklusa, átadja a kettősszálú replikatív szakaszban, és ezen a ponton izolálható a gyűrű alakú molekula alkalmazunk vektorként, mint például a plazmid. A leginkább elterjedt egész sor fág vektorok M13tr által tervezett Messing et al. [Messing et al. 1981 Messing, Vieira, 1982; Vieira, Messing, 1982; Messing, 1983; Norrander et al. 1983 Yanisch-Perron et al. 1985].
Annak ellenére, hogy a segítségével a fág vagy fágemid vektorok, így egyszálú DNS-molekulák nem jelent különösebb problémát, a vágy, hogy nem költenek tisztítás a egyszálú DNS-re az erősen kötött fágok fehérjék kénytelen kutatók olyan megközelítést dolgozzon szekvenálására kettős szálú DNS-molekulák, megállás nélkül, még mielőtt az a tény, hogy a minőség az eredmények mindig ismert, hogy rosszabb, mint az egyszálú szekvenálása kettős szálú DNS-t. (Itt a „minőség” szekvenálás „mennyiség”, az ebben az esetben nukleotidok nagyon szorosan kapcsolódik, hiszen a jobb minőségű a sávok a autoradiográfon szekvenálás gél „olvasni” lesz sokkal többen.) Tehát annak ellenére, hogy a potenciálisan legrosszabb eredményeket, egy nagy számos tanulmány foglalkozik a leírása a különböző megközelítések, hogy készítsen kettős szálú DNS-templátokat alkalmas szekvenálás a didezoxi enzim módszerrel. Az ilyen látszólag irracionális megközelítés magyarázható megnövekedett általános teljesítményt az összes DNS-szekvenálási folyamat időt takarít meg, mint tisztítását egyszálú DNS-templátok és a szükséges gazdaság pereklonirovaniya lapkák speciális fág vagy fágemid vektorba.
A felderítési folyamat szelektív amplifikációját bármely DNS-fragmens PCR-rel és továbbfejlesztése ennek a módszernek, egy lehetőség, speciálisan készítsen kétszálú templát DNS-szekvenálási enzimes módszerrel. Továbbá, igénybe néhány trükköt, akkor lehetséges olyan DNS-templát, vagy dúsított ugyanazon a láncon, vagy csak az egyik lánc.
Előállítása egyszálú templát DNS-t >>>>