A mycoplasmosis laboratóriumi diagnózisa - stadopedia
A mycoplasmák olyan prokarióták, amelyeknek nincs sejtfaluk, és csak háromrétegű membránra korlátozódnak. Polimorfizmusuk van (cocci, filamentumok, elágazó szerkezetek), sejtmentes tápanyag-táptalajon nőnek. A sejtfalak hiánya miatt érzékenyek az ozmotikus sokkra. Az ozmotikus lízis megelőzésére a tápközeg összetételében stabilizáló sók és egyéb anyagok. A mesterséges táptalajokon való növekedéshez szükséges patogén mikoplazmák sok olyan összetevő hozzáadását követelik meg, amelyet nem tudnak szintetizálni. A média összetételének tartalmaznia kell a szérumot a lipoprotein forrásaiként. A szterinek, foszfolipidek, lipidek, patogén mycoplasma mellett alacsony molekulájú fehérje is szükséges. A kapcsolat a fenti E koplazmy tápközegben növesztettük szérummal, kivonatok drozh-Ments, szívizom, kívül, a membrán lipidek vagy predshe-stvennikov.
Hőmérséklet optimum Mycoplasma, Ureaplasma és aholeplazm CO-stavlyaet 37-38 ° C-on, pH = 7,8-8,0, azzal az eltéréssel, Ureaplasma (pH optimuma 6,0).
Minden mikoplazmát elkülönítünk egy független osztályban Mollicules egy egységgel - Mycoplasmatales. amely három családra oszlik: Mycoplasmataceae, Acholeplasmataceae, Spiroplasmataceae. A Mycoplasmataceae család két nemzetségből áll: Mycoplasma és Ureaplasma. Az Acholeoplasmataceae család egy nemzetséggel rendelkezik - Acholeoplasma. A Spiroplasmataceae családot egyetlen nemzetség képviseli - Spiroplasma.
A bakteriológiai kutatások rendszere a diagnózisban
mycoplasmoses
Az anyagot a betegség klinikai megnyilvánulásának korai stádiumaiban, az állatok halálától számított 2-3 órával később, a sterilitás maximális betartásával és a termoszban jéggel szállítják. A mycoplasma izolálása valószínűleg akkor történik, ha az anyag bevétele után az első öt órában a táptalajon végzett vetés történik. 2-3 napos tárolás esetén az anyagot -20 ° C-on, hosszabb ideig - -70 ° C-on, vagy folyékony nitrogénbe helyezzük. A tamponok által szállított anyagot a mycoplasmák szállítóközegébe kell helyezni. Masztitisz-minták szállítása esetén 5 μg / ml ampicillint adunk hozzá.
A polimorfizmus, a színezékek gyenge percepciója és a sejtek törékenysége miatt a színezett készítmények mikroszkópos mikroszkópos kimutatása kevés diagnosztikai értékkel bír. A mikoplazmák hatékonyabb kimutatása és azonosítása fluoreszcens antitestek, ELISA, PCR módszer alkalmazásával.
Annak érdekében, hogy izoláljuk a tenyészet anyagot mycoplasmák szokásosan beoltjuk két csőbe a folyékony táptalajjal, és egy két Petri-csészékben agar. A váladékot és a magzati folyadékot előkezelés nélkül táptalajon bevonjuk. Szövet anyag és intraartikuláris fluidum tartalmazhat inhibitorok, de ezek hígított folyékony tápközegben 10 „6 és mindegyik hígításból inkubáljuk. Szövetek korábban th-mogeniziruyut. A homogenizálást végzünk egy foszfát-puffer-oldatban, vagy folyékony közegben. A túlzottan aprított szövetet nem ajánlott etsya a - az inhibitorok izolálása, a homogenizátum hígításainak elkészítése ugyanazt a célt szolgálja.
Sűrű tápanyag-adalékanyagot a legjobb Petri-csészékbe önteni, mert bizonyos típusú műanyagok gátolják a mikoplazmák növekedését.
Növények szilárd táptalajon inkubáljuk 5-14 napig aerob és anaerob-TION körülmények között 37-38 ° C-on, és mivel a tenyészet elég hosszú ahhoz, hogy elkerüljék a szárítási média úgy hajtjuk végre relatív páratartalom mellett körülbelül 75-80%. A legjobb eredményeket 5-10% CO2-t tartalmazó tenyésztőedények felhasználásával lehet elérni. A folyékony táptalajba inokulált vizsgálati csöveket aerob körülmények között inkubálják, és naponta figyeljék a növekedésre.
A mycoplasmák folyékony táptalajon való növekedésének megerősítésére sűrű tápközegre oltották őket. A sűrű táptalajon történő vetés eredménye 14 nap alatt növekedés hiányában negatívnak tekinthető. Sűrű médiumokon a telepek jelenlétét a mikroszkóp kicsiny növekedése (x25x50) detektálja. A növekedés hiányában,
8 folyadékot adjon folyékony közegben, ötnapos intervallummal, mielőtt negatív eredményt adna. Az ureaplasma elkülönítéséhez minden nap különféle médiumokat kell végrehajtani.
A mikoplazmák a sűrű médiában meglehetősen jellemző kolóniákat alkotnak. A kolónium központja sötét, a periféria átlátszó. Megoldás: a központ emelkedett ("bellied"), a település peremrésze lapos ("tükörtojás" formája). Központi része a kolónia növekszik vastagsága a tápközegben, amely érzékeli, hogy eltávolítjuk a bakteriális tömeg lángolt szikével vagy bakteriológiai kacs pos-leduyuschim alatti közeg vizsgálat helyén mikroszkóppal kolónia-PA.
Amikor a mycoplasma kolóniákhoz hasonló kolóniákat találunk, a klónozást gátlószerek nélkül táptalajon hajtjuk végre tiszta tenyésztés céljából. A tenyésztő táptalajból 10-1-1-10 hígításokat állítunk elő, amelyek mindegyikét (0,2-0,3 ml) két Petri agarlemezre helyezzük. A tiszta tenyészet izolálásához két fő módszert alkalmaznak. Az első esetben az egy telepet tartalmazó agaros közegblokkot vágjuk, fordítjuk és egy sűrű tápközeg felületére vetjük. A növényeket 48-72 órán keresztül inkubáljuk. Az eljárást már három elkülönített gyarmattal ismételjük meg. A második esetben az agarblokkot egy 2-3 ml folyékony tápközegbe helyezett csőbe helyezzük, amelyet inkubálunk
48 óra hosszat 37 ° C-on, a tenyészetet átmegyük membránszűrőn (0,45 μm pórusátmérő). A szűrletet friss tápközeggel 1:10 és 1: 100 arányban hígítjuk, és az egyes hígítások bakteriológiai hurokjának megfelelően az agar táptalajra helyezzük. Pro-tseduru többszörös megismétlődése több településsel, tk. nem minden telep viseli a jó növekedést.
A tenyésztő táptalaj összetételében a mikoplazmák elsődleges tenyésztése során alkalmazott inhibitorok hatására bakteriális szennyezők L-transzformációja lehetséges, ami megköveteli a telepek differenciálódását
A baktériumok és mycoplasmák L-formái.
A baktériumok L-formáinak telepei hasonló morfológiával rendelkeznek, de kevésbé transzparensek és kimagasló szemcsés szerkezetűek.
A pontosabb differenciálódása Mycoplasma bakteriális L-formái pro-sújtó vetés telepek tápanyag agar vagy folyékony közeg nélkül, a penicillin és a tallium-acetát. A növények öt napig inkubálják, rendszeresen vizsgálják az agaron levő telepeket és a tipikus baktériumsejteket folyékony közegben. Jelenlétük az L-forma újbóli változatát jelzi az eredeti állapotban.
Ezenkívül a mycoplasmák és a baktériumok L-formáinak kolóniáit a Dines módszerrel festettük. Erre a kimetszett agar-agar blokkot a vizsgált telep Dines alkalmazott néhány csepp festék (metilénkék - 2,4 g, maltóz - 10 g, Azure II - 1,25 g nátrium-kloridot - 0,25 g, desztillált víz - 100 ml) néhány percig mossa le a készüléket vízzel és vizsgálja meg. Kezdetben minden telepek színe kék, de negyedóra múlva baktériumteiepek, Otley, Chie származó mycoplasma elszíneződött csökkenése miatt a metilénkék. Figyelembe veszik azt is, hogy a normál baktériumok telepei megfesthetők festés közben, és a mikoplazmák nem.
Annak megállapításához, a morfológiai és a színező tulajdonságok mikoplazma sejtekből állítjuk elő üveglapokra nyomatok telepek tenyészetének ár-trifugiruyut tys.g 10-15, és a csapadékot egyszer mossuk desztillált vízzel fürdő és előkészíti keneteket. A készítményeket metanollal, acetonnal rögzítjük, és Gram és Romanovsky-Giemsa festékkel (1:10) 3-4 órán keresztül festjük. Mycoplasma Gram festés negatív festés Ro-Ekman-Giemsa mycoplasma aholeplazmy - világos lila, Ureaplasma - piros-lila színű.
A tenyészeteket Mycoplasma működés közben tartjuk való átoltással ra tápanyag folyékony közegek 2-3 hetes intervallumokban, és tároltuk 4-5 ° C-on A agar tenyészet fagyasztva tároltuk formájában agaróz blokkok rovyh-30 -------- ------------- 40 ° С.
Általános azonosítása izolált tiszta tenyészeteit Mycoplasma (Mycoplasma nemzetségek, Ureaplsma, acholeplasma) által hordozott chuvstvitelnos látnia, hogy digitoninnai és ureáz aktivitást az átmérője mikrotelepek az alábbi reakcióvázlatban bemutatott.
A mycoplasma specifikus azonosítását további jellemzőkkel, enzimatikus aktivitással tanulmányozzuk. A bakteriológiai kutatás különböző fázisaiban a mikoplazmák azonosítására szolgáló szerológiai módszereket alkalmazzák. Egyes mikoplazmózis diagnosztizálásakor biológiai tesztet és szerológiai diagnózist alkalmaznak.
A mycoplasma azonosításához használt legfontosabb kutatási módszereket az alábbiakban ismertetjük.