A nukleinsavak koncentrációjának és a készítmény tisztaságának meghatározása
A nukleinsavak (DNS vagy RNS) koncentrációjának meghatározására szolgáló módszer egy megoldásnál a legnagyobb felszívódáson alapul a DNS-ben és az RNS-ben, 260 nm hullámhosszon. Ez azt jelenti, hogy a nukleinsav-oldatokban a maximális fotometriai abszorpció 260 nm-nél van megfigyelhető és közvetlenül összefügg a DNS vagy RNS koncentrációjával.
A DNS vagy RNS előállításának tisztaságának meghatározása
A 260 nm és 280 nm hullámhosszúságú (260 nm / 280 nm) abszorpciós arány a DNS vagy RNS előállításának tisztaságát mutatja. A gyógyszer akkor tekinthető tisztanak, ha a 260nm / 280nm értékek aránya körülbelül 1,8 a DNS és az RNS 2,8 esetében. A 260 nm / 280 nm-es kisebb értékek esetén a készítmény nagy mennyiségű szennyeződést tartalmaz fehérje, fenol vagy más szennyező anyagok esetében, amelyek jelentős abszorpciót mutatnak 280 nm-en.
A DNS- vagy RNS-készítmény tisztaságának másik mércéje a 260 nm / 230 nm abszorbanciaértékek aránya. Tiszta gyógyszer esetén ez az arány általában 1,8-2,2. A 260nm / 230nm kisebb együttható értéke azt jelzi, hogy a készítmény olyan komponensekkel szennyezett, amelyek a DNS- vagy RNS-elkülönítési eljárás után maradnak.
Módszer a DNS és az RNS koncentrációjának meghatározására az oldatban: az ábra mutatja a DNS-oldat vízben való abszorpciós spektrumát maximum 260 nm-nél
A DNS-készítmény koncentrációja 3,6 μg / μl volt. Cuvette optikai úthosszúság 1 mm, térfogat - 200 μl
A 260 nm-es és 280 nm hullámhosszúságú (260 nm / 280 nm) hullámhosszúságú abszorpciós arány 1,73, ami a DNS előkészítésének viszonylag magas tisztaságát jelzi
Az abszorpciós spektrum a 30 mérés eredményeinek automatikus (szoftveres) átlagolásából származik 10 ms időtartammal
A nukleinsavak koncentrációjának és a készítmény tisztaságának meghatározása 200 μl térfogatú (1 mm-es optikai úthossz) vagy 1000 μl (10 mm-es optikai úthossz) küvettákban hajtható végre,
Lehetőség van abszorpciós spektrum grafikonok és abszorpciós értékek létrehozására egy hullámhosszon 12 mintán egy üresen
A teljes abszorpciós spektrum értékei MS Exel formátumba alakíthatók
A mérés elvégzése után a DNS-mintát desztillált vízzel 40-szer hígítjuk (195 μl vizet adunk 5 μl DNS-oldathoz). Az abszorbancia-mérést 260 nm-en egy 1 mm-es optikai úthosszúságú küvettában végezzük víz alkalmazásával referenciaként. A kiindulási oldatban lévő DNS-koncentráció értékét (μg / μl) az abszorbancia értékének 260 nm-es hullámhosszúságával megszorozva találjuk meg K = 20 értékkel.
Az RNS-t 10-szer vízzel hígítjuk (180 μl vizet adunk hozzá egy 20 μl DNS-oldathoz). Az abszorbancia-mérést 260 nm-en egy 1 mm-es optikai úthosszúságú küvettában végezzük víz alkalmazásával referenciaként. Az RNS-koncentrációt a kezdeti oldatban (μg / μl) az abszorbancia értékének 260 nm-es hullámhosszúságával megszorozva találjuk meg K = 4 értékkel.