A fehérjék integrálása a membránba
A külső tápközegben lévő, megfelelő körülmények között elhelyezkedő prekurzor polipeptidet a vezikulum belsejébe vagy legalább a vezikula vagy organella membránján keresztül szállítjuk. Ezt a folyamatot általában a proteázoknak a külső környezetbe történő hozzáadásával monitorozzák. A proteolízissel szembeni védelem mértéke a vezikulumban vagy organelleibe szállított polipeptid mennyisége. A jel-peptidáz által végzett proteolitikus folyamatot poliakrilamid-gélelektroforézissel figyeljük SDS jelenlétében. A membránba ágyazott fehérjéket lúgos extrakcióval lehet azonosítani, feltételezve, hogy a membrán felületén lévő fehérjéket eltávolítják a kezelés alatt. Ez azonban nem mindig így van, ezért a lúgos extrahálással kapott eredményeket óvatosan kell értelmezni.
Ilyen sejtmentes rendszerekben meg lehet vizsgálni a fehérje transzmissziójának biokémiai körülményeit és azonosítani a szükséges oldható komponenseket. Ezenkívül a tolerálható polipeptid "szubsztrátjának" jellege változtatható.
A sejtmentes rendszerek vizsgálatakor nagyon fontos adatokat kaptak a fehérjék átviteléhez szükséges körülmények között.
1. A poszttranszlációs és a kotranszlációs transzfer. Általánosan elfogadott, hogy minden vizsgált rendszerben a membránokon vagy a membránokon keresztül történő szállítás a fordítástól függetlenül fordulhat elő. E tárgyban meggyõzõ adatokat kaptunk a kloroplaszták és a mitokondriumok fehérjeátvitelének folyamatára, valamint a bakteriális membránon keresztüli szállításra. Hosszú ideig azt hitték, hogy az átutalás a fehérjéket az endoplazmatikus retikulumba, vagy a membránon keresztül az endoplazmás retikulum mindig párhuzamosan hajtjuk végre, hogy a fordítást, de ez világosan mutatja, hogy az ilyen párhuzamosság nem szükséges. Fontos továbbá az is, hogy a szállításhoz szükséges energia nem a riboszómális bioszintetikus készülékből származik.
2. Energiaátviteli követelmények. Általában a fehérjék membránba való átjutása vagy ezeken keresztül történő ingadozása ingatag. Mind a prokarióta, mind az eukarióta rendszerek számára szükséges szállítási feltétel az ATP (vagy más nukleozid-trifoszfát) hidrolízise. Ezt a következő folyamatokról mutattuk ki: a) fehérjék transzportálása a kloroplasztok sztrómájába; b) fehérjék szállítása a mitokondriális mátrixba, belső és külső membránokba; c) fehérjék átadása az élesztő endoplazmatikus retikulumán és a membránfehérjék utáni transzlációs beépülése emlősök endoplazmatikus retikulumába; d) fehérjék átvitelét az E. coli citoplazmatikus membránján keresztül.
Egy másik független feltétel a fehérjéknek a mitokondriális mátrixba és a mitokondriumok belső membránjába történő átviteléhez az utolsó transzmembrán potenciál jelenléte. Ez a lehetőség nyilvánvalóan szükséges a folyamat korai szakaszában, amikor a fehérje kötődik a mitokondriához.
3. Az elődje képes átruházni. Erős érvek támasztják alá, hogy a kvaterner szerkezete kulcsszerepet játszik a sikeres fehérjeátadásban. Valószínűleg ez annak a ténynek köszönhető, hogy az átviteli eszköz által felismert jelszekvencia (ti) rendelkezésére kell állnia. Ezért az átvitel végrehajtásához a fehérjét lazán kell hajtani vagy részlegesen ki kell húzni. Ezenkívül, ha a fehérjéket a membránon keresztül hosszúkás konformáción keresztül szállítják, akkor az átviteli eszköznek képesnek kell lennie a transzfer folyamat során. Ha a fehérje prekurzorok stabil kvaterner struktúrával rendelkeznek, akkor alig hajlamosak lesznek kibontakozni és következésképpen nem képesek továbbadni.
A fehérjék szállítása kiterjedt formában történik. ATP szükséges a polipeptid kibontásához. A feloldás az átvitel előtt vagy párhuzamosan következik be. Ez ATP szükséges ez a folyamat az a tény, hogy a közlekedés lerövidül elődei, ellentétben a közlekedés teljes hosszúságú fehérje lehet végezni ATP hiányában. Ezeket az adatokat először a mitokondriális membrán tanulmányozása alapján végeztük. Annak érdekében, hogy megakadályozzuk a prekurzor koagulációját a natív konformációba, minden oldható fehérje kofaktorra van szükség. Tehát, úgy izoláljuk, amint a vízben oldható formában, hasonló porin mitokondriális prekurzor E. coli külső membrán protein OmpA, amely nem volt képes hatékony átvitelét a plazmamembrán, ha a protein hiányzik a citoszolban, úgynevezett „trigger faktor”. Az is ismert, hogy annak érdekében, hogy át a membránon keresztül fehérjék az endoplazmás retikulum emlős vagy endoplazmaticheky retikulum oldható kofaktor szükséges - nevezetesen, a jel-részecske (MPS). Talán ennek a tényezőnek az a szerepe, hogy megakadályozza a polipeptid prekurzor összecsukását.
2. A fehérjék integrálása a membránba
2.1 A jel hipotézise
A fehérjék sokféle módon ágyazódnak be a membránba, de a folyamat részleteit sok esetben még nem bizonyították. A beágyazás mechanizmusának megmagyarázására két modellt javasolnak: egy jel hipotézist és egy membránindító hipotézist. A jelhipotézisben azt feltételezzük, hogy a fehérje a membránban párhuzamosan helyezkedik el a mágneses polimerizációban mRNS-ben történő transzlációjával; ez az úgynevezett keltranszlációs integráció. Amikor a vezető szekvencia megy a riboszóma, azt észleljük, néhány jel-mintát részecske (APS), amely blokkolja a további sugároznak körülbelül 70 aminosav, 40. amelyek továbbra is a nagy riboszomális komplex, és a 30 ki vannak téve a környezetben. Az SRF hat fehérjét tartalmaz, 7S-RNS-t, ezzel szorosan összefüggő "Alu-család" DNS-szekvenciákat, amelyek nagy számú ismétlődéssel rendelkeznek. Blokkoló fordítást nem lehet eltávolítani, amíg a komplex MPS-vezető szekvencia - riboszóma nem érintkezik az úgynevezett „cut off” fehérje (receptor az MPS) az endoplazmás retikulum. Ezen a ponton kezdődik a szövettani beágyazódás az endoplazmatikus retikulumba. Során a maradék fehérje megnyúlás az áthalad a lipid kettős réteg, például a riboszóma csatlakoztatva marad az endoplazmatikus retikulumban. Így kialakul egy endoplazmatikus retikulum (riboszomális riboszómákkal). A riboszómák kapcsoltak maradnak az endoplazmás retikulum membrán fehérje vtechenii teljes szintézise időt és eltávolítottuk és a disszociált be alegységek megfelelő csak annak befejezését követően. Amikor a protein korábban szintetizált része belép az endoplazmatikus retikulum lumenébe, a vezető szekvencia leválik és szénhidrátokat adnak hozzá.
Az integrális membránfehérjék nem keresztezik a teljes membránt; nyilvánvalóan ez akadályozza a hidrofil horgonyszekvenciát a C-terminálison. A szekretált fehérjék teljesen átmennek a membrán kétrétegű rétegen, és az endoplazmatikus retikulum lumenébe engedik. Mire belépnek a hólyagokba, szénhidrát maradványok már hozzákapcsolódnak hozzájuk. Ezt követően, szekretált fehérjéket találtak a lumen a Golgi-készülék, ahol a módosítást a szénhidrát láncok, és akkor mozog a specifikus intracelluláris organellum vagy sejtmembrán vagy szekretált. Egyes fehérjék átmennek egy membránon, majd egy másik szomszédos membránon, például a mitokondriumok belső membránján horgonyoznak.