Knockout egér
Knockout egér - genetikailag megváltoztatott egér, amelyben az egy vagy több gén expressziója ki van kapcsolva génkiütés alkalmazásával. A knockout egerek fontos modellek a szekvenált állati gének vizsgálatához, de amelyek funkciója ismeretlen. Egy egérben lévő specifikus gén inaktiválása és a fenotípus (viselkedés, megjelenés) változásainak vizsgálata során a kutatók gyakran következtetéseket vonhatnak le e gén működéséről.
Az egerek a legközelebb állnak az emberi modellszervezethez, amelyre a kutatási módszer alkalmazható, még akkor is, ha patkányokat alkalmaznak, sokkal nehezebb. Ezért az egereket széles körben alkalmazzák az emberi fiziológiához kapcsolódó vizsgálatokban.
használata
A gén leállítása segít a kutatóknak a funkciójának megismerésében. Mivel az egerek és az emberek számos génje gyakori, az egerek működésének vizsgálata lehetővé teszi, hogy adatokat szerezzen arról, hogy ez (vagy hasonló gén) megfelel-e az emberi szervezetben. Különösen fontos az emberi betegségekért felelős gének azonosítása. Példák olyan vizsgálatokra, amelyekben a knockout egerek felhasználhatók különböző típusú rákok, elhízás, szívbetegségek, cukorbetegség, ízületi gyulladás, öregedés és Parkinson-kór kezelésére és modellezésére. A knockout egerek segítségével megvizsgálhatja a gyógyszereket és a különböző típusú terápiát. Évente több millió knockout egeret használnak különböző kísérletekben.
Több ezer sor knockout egér van. Számos egérmodell van elnevezve az inaktiválandó gén számára. Például a p53 knockout egereket a p53 génre nevezték el, amely egy fehérjét kódol, amelynek egyik legfontosabb funkciója a sejtosztódás abbahagyása miatt a tumor növekedésének megszüntetése. A Li-Fraumeni-szindrómában szenvedő p53-gén mutációival született emberek egyidejűleg katasztrofálisan növelik a csont-, vér- és emlőrák kialakulásának valószínűségét korai korban.
Van néhány eltérés a knockout egerek megszerzésére irányuló eljárásokban, de az alábbiakban egy általánosan egyszerűsített rendszer.
- A gént, amelyik ki akarja pusztítani, az egérgén könyvtárból izolálódik. A DNS-szekvencia ezután megváltozik, hogy a gén nem működik. Általában, egy új szekvenciát is meg kell egy marker gént, amely nincs jelen a normál egerekben, és felelős a rezisztencia bármely antibiotikum, egy toxikus anyag, vagy nyújt valamilyen látható változás (szín fluoreszcencia).
- Az embrionális sejteket az egér blasztocisztákból izolálják és in vitro termesztik. Ebben a példában a blastociszta sejteket fehér egérből vettük.
- Az 1 lépésből álló új szekvenciát elektroporációval átvisszük a blastocisztasejtekre. Természetes homológ rekombináció segítségével néhány új embrionális sejtben egy új szekvencia beiktatása egy kiütött génbe egy normál gén helyett. A sikeres rekombináció esélyei viszonylag alacsonyak, tehát a legtöbb sejtnek van egy új szekvenciája a két kromoszómának mindegyikében - heterozigóta lesz.
- A knockout gént hordozó embriósejteket markergén segítségével izoláljuk (lásd 1. lépés). Például a beillesztés nélküli sejtek nem maradnak fenn egy toxikus ágens hatása alatt, amelyre a vizsgálandó génre rezisztens knockouts a sejtek.
- A 4. lépésből származó kopogtatott őssejteket rágcsáló blasztocisztákba (ez esetben szürke egérbe) beültetik. Most a blasztociszták kétféle őssejtet tartalmaznak: vad típusú (szürke egerek) és kiütéses sejtek (fehér egerek). Ezeket a blasztocitákat az örökbefogadó anya méhébe ültetik be. Az újszülött egerek testének egyes részei vad típusú sejtekből származnak, és néhány kiütéses sejtet, ilyen egereket szeszélyesnek és szürkésfehér színnek neveznek. Ha átléped a bizarr egereket egymással, az utódok egy része fehér lesz, és homozigóta lesz a knockout genom számára.
korlátozások
Habár az egerek génjeinek kiütése rendkívül hatékony eszköz a kutatáshoz, jelentősége van annak használatában. A génkiütés körülbelül 15% -a halálos az embrionális fejlődés során. Ez a probléma elkerülhető a hagyományos knockout egerek megszerzésével.
A gének kopogtatásakor az egerek néha nehezen különböznek egyértelműen a vad típusú fenotípustól. Néha problémák vannak a gén inaktiválásának összehasonlításában az emberi szervezetben és az egérrel. Például a p53 gén mutációja, amely a humán daganatok felében bizonyos szövetekben daganatok kialakulásához vezet. A p53 knockout egerekben a rák teljesen más szövetekben fejlődik ki, mint a fent említett humán mutációkban.
