Módszerek tanulmányozása mobilitásának mikrotubulus motoros fehérjékkel

• Motorfehérjék aktívak sejtkivonatokban. Ez lehetővé teszi, hogy elossza tisztított formában

• Motorfehérjék csatolt az üveg és a felületet biztosítanak siklik mikrotubulusok

• Gyöngyök - bevont gyöngyöket motoros fehérjék, lehet szállítani mikrotubulusok

• A mikrotubulusok a polaritásra, lehetséges, hogy meghatározzák, milyen irányba mozog a motor

A felfedezés és izolálását a mikrotubulus motoros fehérjékkel összefüggésbe hozták az új technikák, amelyek lehetővé teszik a kutatók, hogy tanulmányozza a mobilitás az extraktumokat a sejtek in vitro vagy tisztított készítményeket fehérje motorok. Nyitás által kinezin vezetett megfigyelése mozgó vezikulumok a nyers extraktumban sejtek - lényegében hígítatlan citoplazmában - főzött egyetlen óriás axon a tintahal.

Az axon perspektivikus objektum, hogy megtalálják az ilyen molekuláris motorok miatt intenzív mozgás mikrotubulusokat végezzük vezikulumok. Az óriás axon a tintahal elválasztjuk a testet, és ki az extrudált citoplazmában (vagy axoplasm mint szívesebben hívja idegtudományi), amely figyelemmel kíséri a mozgását helyezünk egy üveglapon. A frakcionálás axoplasm és motilitás vizsgálatok minden frakció Ron Vail et al. izolált az első kinezin motorok.

Szemben a hagyományos biokémiai vizsgálatok. végezzük kémcsövek, a mobilitás mikroszkóp alatt vizsgáltuk, amely lehetővé teszi számunkra, hogy nyomon követni a mozgását, amely el van látva a motorhoz. Hogy a mikroszkóp alatt megfigyelhető, a tevékenység a motor? Annak érdekében, hogy érzékelik a mozgást, meg kell, hogy kövesse az objektumot az időben. Ebben az esetben meg kell natív fehérjéket. Az alkalmazás elektronmikroszkópos kizárt.

Utóbbi esetben szükség erőteljes kémiai kezeléseket a minták, amelyek inaktiválják fehérjéket. Fénymikroszkópia van egy ilyen nagy felbontású, mint a elektronnnaya, de megvan az az előnye, hogy általában kevesebb durva minták feldolgozására vagy nem követeli. Ezért, akkor lehet használni, hogy tanulmányozza a folyamatok igényelnek aktív fehérjéket, és amelyek néhány percig tart, vagy hosszabb. A mikrotubulusok azonban túl kicsi ahhoz, hogy a velük kapcsolatban álló mobilitási lehetett látni a hagyományos fénymikroszkóp.

A fényképek mikrotubulusok kapott DIC-mikroszkóppal, majd számítógép javítása.
A kép szemcsés, de világosan mutatja a helyzetét a mikrotubulus és a hossza.
Ezzel a módszerrel meg lehet mérni a hosszát a mikrotubulusasszociált, figyelemmel kíséri a mobilitás és a szállítási folyamatok, amelyekben részt vesznek.

Érdekes, hogy a tanulmány a fehérje mobilitás motor rakomány van szükség. Ez azért van, mert ellentétben a mikrotubulusok, fehérje motor csatlakozik üveg felületek (mikroszkóptárgylemezek és fedőlemez). Kötődés után az üveg csak a motorok, tevékenységük lehetővé mikrotubulusok mozgatni az egész felületén. Alkalmas példák Az ábrákon bemutatott alábbi.

Teszt elmozdulás mikrotubulusok-t használni, hogy tanulmányozza biokémiai frakciók, hogy végzett tisztítás során kaptuk az első kinezin. Ezt a tesztet általánosan használják, hogy tanulmányozza a mikrotubulus motoros fehérjékkel. Az egyik módosítás segítségével üveg vagy latex gyöngyök bevont fehérje motorok, és azok mozgása volt megfigyelhető a mikrotubulusok.

Ez a „businochnaya teszt” egy kicsit bonyolultabb, mert a gyöngyök és a mikrotubulusok kell jegyezni fénymikroszkóppal. Minden esetben először stabilizálni a mikrotubulusok kötődve azokat paclitaxel.

A jellemző fehérje motorok az, hogy képes mozogni a mikrotubulusok mentén csak egy irányban. Annak megállapítására, hogy a motor felé plusz vagy mínusz vég mozog, akkor vysyanit hogyan határozza meg a polaritás a mikrotubulusok. Az egyik módja, hogy meghatározza a polaritás, első szerelvény tartalmaz egy sugárirányú mikrotubulus struktúrák izolált centroszómákhoz, majd rögzítése őket egy mikroszkóp tárgylemezre. Ezután visszük fel a üveggyöngyök és nézni a mozgás.

Ugyanakkor gyöngyöket. bevonva egy fehérje motorral, amelyek mozognak, hogy a központ a szerkezet, mozgatni, hogy a mínusz végén, és azok, akik mozognak a központtól, mozgassa, hogy a plusz vége. Egy másik módja, hogy jelölje polaritás alapján mikrotubuiuspolimerizációra gyorsabb plusz-terminus. először egy próbaüzem rövid mikrotubulusok alkotnak egy nagyon nagy százalékban alegységek tartalmazó fluoreszcens próbát. Ezek a fényesen izzó mikrotubulusok használjuk azután nukleációs központok hosszabb mikriotrubochek olyan oldatban, amely sokkal alacsonyabb százalékban fluoreszcens tubulin.

Tubulinmolekulát adunk mindkét végén a csövek nukleációs központok, de sokkal gyorsabb, hogy a plusz vége. Az eredmény egy sor mikrotubulusokat egy rövid, nagyon világos rész a közepén, és egy tompa, de látható részek a végein. Ábrázoljuk a plusz-end gorazo hosszabb, mint egy negatív vége, amely azonnal lehetővé teszi, hogy meghatározzuk a polaritása mikrotubulusok. Ezek a fluoreszcens mikrotubulusok a polaritásra lehet használni, hogy meghatározzuk a mobilitás érdekében, hogy meghatározzuk a mozgás irányát. Fontos megjegyezni, hogy a fehérje motorok vannak rögzítve értelmezésekor kísérleti eredmények.

Amikor a motor irányába mozog a mikrotubulusok plusz-end továbbléphetünk annak mínusz végén. Szinte minden módszer mozgékonyságát variánsai ezeket a teszteket. A természet a célkitűzések részletes kísérleti eszközök, és lehetővé teszi az érzékelő rendszer eltérő lehet, de az alapelv ugyanaz marad.