A gyógyszer a megelőzés és a kezelés a diftéria és annak gyártási módszer
A találmány a gyógyászat, különösen in Immunology, és fel lehet használni a immunprofilaxist és immunterápia diftéria.
A hagyományos módszer kezelésére diftéria intramuszkuláris diftéria szérum (PDS), véréből nyert lovak hiperimmunizált diftéria toxoid tartalmazó specifikus immunglobulinok, amelyek semlegesítik a bakteriális toxinok diftéria. Az 1 ml szérumot tartalmazott, legalább 1500 nemzetközi egység antitoxikus aktivitását (NE). Mint hatékony módja kezelésére diftéria, PPP számos hátránya van: a bevezetése jelentős mennyiségű idegen protein biztosítja a lehetőségét anafilaxiás reakciók és szérumbetegség (LA Favorova stb Diftéria - M. Medicine, 1988. - P. 187-192 ..).
Azonban ez a módszer nem teszi lehetővé, hogy kapjunk termékek magas tisztaság: a végtermék egy sor F (ab) 2 fragmentumokat immunglobulinok különböző specificitású, ahol az antitest (antitoxin) az antigén elleni immunizált termelő jelentenek nem több, mint 25% az összes fehérjetartalom . Következésképpen antitoxikus szérum maradnak túlterhelt ballaszt fehérjék és egyes esetekben okozhat anafilaxiás reakciókat a változó súlyosságú a címzett. Továbbá, készítmények szennyezett vércsoport anyagokat (HVA), ami szintén komplikációkat okozhat a beadása szérumok.
Műszaki hatás A találmány lényege, hogy kapjanak nagy tisztaságú készítmény antidiphtheria csökkentett reaktogenitást heterogén anyagok. A gyógyszer a megelőzés és a kezelés a diftéria egy liofilizált formában.
A probléma megoldódott, hogy elkészítjük a gyógyszer a megelőzés és a kezelés a diftéria fermentált hiperimmun lószérummal immunaffinitás tisztítási.
A kapott készítményt monofraktsionnym, míg a készítmény prototípus hangsúlyos szennyező inaktív fehérjét (ábra. 1). A gyógyszer a megelőzés és a kezelés a diftéria van monoretseptornym: kettős immu válaszul diftéria toxoid alkot egy precipitá-ciós vonalat, míg a szérum (prototípus) - 2-3 vonal (2. ábra).
Jellemzői kapott készítmény ismert eljárásokkal és a javasolt, táblázatban mutatjuk be. 1-3.
A magas fokú tisztítást és hiányzik HVA biztosít csökkentett reaktogenitást gyógyszer megelőzésére és kezelésére a diftéria, nyert heterogén anyagok (1. táblázat, 2. ,.), míg van egy magas védő tulajdonságait: minimális dózis antitoxin szérumok 0,03-0,125 NE / ml megfelelő védő titer diftéria védi 100% -a az állatoknak beadásával 1,8-5,6 LD50 diftéria toxin (táblázat. 3.). A fagyasztva szárítás lehetővé teszi, hogy így igen aktív száraz adagolási készítmények alkalmasak a hosszú távú tárolás során.
A készítmény a gyógyszer a megelőzés és a kezelés a diftéria használat hiperimmun lószérumot, amelyhez erjesztik pepszinnel hajtjuk kisózással a fehérjék és fehérje denaturáció ballaszt. Izolálása A kívánt terméket a fermentált hiperimmun szérum alkalmazásával végeztük specifikus immunszorbens tartalmazó ligandumot koncentrált tisztított diftéria toxoid. A készítményt koncentráljuk ultraszűréssel membránok retenciós anyagok küszöbérték molekulatömege 100 kD. Sterilizálószűrés végezzük membránok pórusátmérőjű 0,22 mikron.
1. példa hiperimmun szérumot enzimes hidrolízis.
30 liter hiperimmun lószérum töltöttünk egy reaktorba, és hígítjuk 60 liter pirogénmentes desztillált vizet, hogy a fehérjetartalom a 3%. Vezetünk be keverés közben 243 g pepszinnel feloldjuk kis mennyiségű savanyított desztillált vízben. A proteolízis hajtjuk végre pH 3,2 szobahőmérsékleten 1 óra és 1 órán át pH = 4,2. (PH-ját a kívánt értékre, 2,5 mol / l-es sósavval, vagy 2,5 mol / l-es nátrium-hidroxid).
Végén 2. óra proteolízis a reaktorba a töltés port hozzáadjuk 14,5% ammónium-szulfát (13 kg), a pH 4,3-4,33. A reakcióelegyet felmelegítettük 56 ° C-on és ezen a hőmérsékleten tartjuk 45 percig. Ezután fermentátumból megszabadítjuk az előtét fehérje átszűrve muszlin kazettás szűrőket. A csapadékot ballaszt fehérjék eldobtuk, és a tiszta szűrletet tartalmazó fehérjét antitoxikus aktivitását összegyűjtjük és tápláljuk azt 7,0-7,2 pH.
2. reakciólépés: monospecifikus immunszorbens.
Egy standard készítmény segítségével immunszorbens tsianbromirovannoy Sepharose 4B ( „Pharmacia, Svédország”), és mint specifikus ligandum - tisztított diftéria toxoid koncentrátum aktivitása 450 Lf / ml. 200 g száraz Sepharose öntjük két liter 0,001 mol / l-es sósavoldatban 30 percen mentesre mossuk, tartósítószerek ugyanezzel az oldattal. 1,2 liter diftéria toxoid a csapadékkal egyesítjük duzzasztott Sepharose (900 ml) keverjük, és inkubáltuk 4 ° C-on 24 órán át. Amely után a felülúszó térfogata (V1) és a toxoid titer (T1) a flokkulációs reakció. Ha a titer nem haladja meg a 10 Lf / ml, a leöntött dobni, különben továbbra szorpciós. A képződött komplexet Sepharose - toxoid mentesre mossuk a nem kötött fehérje steril pirogénmentes karbonát-bikarbonát pufferben, pH 9,0 ellenőrzés alatt spektrofotometriával. Az utolsó része a mosóvíz létrehozását követően semleges pH-t ellenőrizzük pirogén a szokásos módon.
Hiányában pirogének a mosóvizek szabad aktív csoportokkal blokkolt Sepharose tsianbromirovannoy két liter 1 mol / l etanol-amin-oldat pH-ja 9,0, két óra hosszat sötét helyen, állandó keverés közben.
Immunadszorbeans háromszorosan mossuk váltakozva steril, pirogénmentes puffer-oldatok: 2 literes acetát, pH = 4,0; 2 l bórsav-borát, pH 8,0. A mosófolyadékot (V1) vezérli jelenlétére diftéria toxoid flokkulációs reakció (T2). Titer immunszorbenshez képlettel számítjuk ki A - titer immunoszorbens; V, T - térfogata és titerje toxoid; V1. T1 - az a térfogat, és a titert a felülúszó; V2. T2 - az a térfogat, és a titert mosóvíz; C - összeg immunoszorbens.
Így, 900 ml immunoszorbens szuszpenzió, amelynek titere 588 Lf / ml.
3. izolálása monoretseptornoy frakció F (ab) 2 fragmentumokat ló IgG, hatóanyag-koncentrációk.
Elkülöníteni az F (ab) 2 fragmentumokat IgG ló használt oszlop nélküli „Batch” -módszer. Ebben az esetben az összes kondenzátorok használt, és a megoldásokat kell steril és pirogénmentes. Szorbens és erjesztett savó antitoxikus aktivitását 110 NE / ml-t kevertünk a mennyisége egyenértékű titereket
ahol VPH. TFR - volumen és titer fermentátumból,
Vi.s .. Ti.s. - a mennyiség és a titer immunszorbens.
Ie egy részletben immunszorbens elegendő kimerülése 4,8 l fermentált diftéria antitoxikus szérum.
Szorpciós specifikus antitestek végezzük szobahőmérsékleten 1 órán át, pH = 7,0. Szorbens mentesre mossuk, a nem kötött fehérje pirogénmentes steril pufferolt sóoldattal (PBS) pH 7,0 nullára spektrofotométerrel leolvasott. Tól eluensként steril, pirogénmentes PBS-sel, pH-ra savanyítjuk 2,2 - 2,4 1 mol / l sósavat.
Immunadszorbens mentesre mossuk fehérjét PBS-sel (pH = 7,0), és a tárolt steril, pirogénmentes bórsav-borát puffer oldattal (pH = 8,0) 4 ° C-on immunszorbens használni többször (20-szor).
Betöményítjük, így 3 liter affinitással tisztított F (ab) 2-fragmens IgG-t ló aktivitással 2500 NE / ml fehérjét és 3%. Tisztított, koncentrált antitoxin derítjük egymást követő szűréssel membránon át pórusátmérőjű 0,8-0,65-0,45 mikron. Sterilizálószűrés végezzük membránok pórusátmérőjű 0,22 mikron. A steril készítményt megelőzésére és kezelésére a diftéria fiolákba töltjük, 1,0 ml.
Ampullák előállítására megelőzésére és kezelésére diftéria helyezni a befogadó kazettát, és hozott egy befagyasztása alacsony hőmérsékleten berendezésben TG-counter 50 nyújtó-fagyasztási hőmérsékleten legalább mínusz 38 ° C-on Amikor kényszerhűtött készítményt fagyasztjuk legalább 18 órán át anélkül kényszerhűtött kevesebb, mint 20 óra. Betöltés szublimációs által gyártott termék a kondenzátor hőmérséklete eléri nem magasabb, mint mínusz 50 ° C-on, polcok nem magasabb, mint mínusz 15 ° C-on Ezt követően szublimációs kiürítették. felolvasztás pont a hatóanyag mínusz 33-36 ° C-on Ha a hőmérséklet elérte a hatóanyag legfeljebb mínusz 38 ° C-on és vákuumban stabilizáló nem több, mint 9 Pa indul polcán. Után egy órával a fűtési terhelés 0 o C, majd 5 ° C per óra. A végső hőkezelést polcok 34-40 ° C-on való állás után a gyógyszer nulla hőmérsékleten 20 órán át szárítást befejezettnek tekintjük.
Így a javasolt módszer lehetővé teszi, hogy kapjunk egy gyógyszer a megelőzés és a kezelés a diftéria csökkentett reaktogenitást rendelkező magas védő tulajdonságait, liofilizált formában.
1. Egy készítmény megelőzésére és kezelésére a diftéria, tartalmazó F (ab) 2 IgG fragmensek ló, azzal jellemezve, hogy ez egy frakciót monoretseptornuyu F (ab) 2-fragmens IgG ló antitestek aktivitása protivodefteriynyh legalább 2500 NE / ml, és tartalmaz adjuvánsként 0,9% nátrium-klorid oldattal pH = 6,8-7,2 a következő arányban összetevők:
Monoretseptornaya frakció F (ab) 2-fragmens IgG ló-anti-diftéria antitest aktivitása legalább 2500 NE / ml - 3 - 4 tömeg%.
0,9% nátrium-klorid-oldattal pH 6,8 - 7,2 - ad 1 ml
2. a hatóanyag-megelőzésére és kezelésére a diftéria 1. igénypont szerinti, azzal jellemezve, hogy ez egy liofilizált formában.
3. Eljárás készítmény előállítására a megelőzés és a kezelés a diftéria, amely enzimatikus hidrolízis pepszinnel hiperimmun lószérum, azzal jellemezve, hogy a fermentáció után végezzük frakcionálásával só és denaturálódásának savófehérjét izoláljuk a kívánt terméket keresztül végezzük specifikus immunszorbens tartalmazó ligandumot koncentrált tisztított diftéria toxoid, majd koncentráljuk ultraszűréssel membránok retenciós anyagok küszöbérték molekulatömegű 100 D, sterilizáló szűréssel membránokon pórusátmérőjű 0,22 mikron.