DNS klónozás, a titkait a tudomány, a világ a láthatatlan

DNS Cloning - a rekombináns DNS technológia izolálására és szaporítása egy adott nukleotidszekvencia lévő komplex keveréke DNS-fragmensek. Erre a célra, kezdetben minden keveréket DNS-fragmensek bejuttatjuk a klónozó vektorba. majd szűrésével kiválasztott ezek között a rekombináns molekulák a célszekvenciát tartalmazó DNS-fragmenst, például. gént. majd hajtsa végre a terjedési bevezetésével egy kiválasztott rekombináns DNS-t egy alkalmas gazdasejtbe pl. a E. coli.

DNS klónozása magában foglalja a 6 szakaszokban:

1) DNS-t nyerünk fragmentumokat, beleértve a géneket, vagy azok részei egy restrikciós enzimmel;

2) rekombináció a fragmensek

3) behelyezése a DNS-fragmenst egy vektorba;

4) transzformációs vektorral a gazdaszervezet;

5) Átvizsgálás a rekombináns vektor

6) klónok kiválasztása az érdeke, hogy a kutatók.

A restrikciós enzimeket. Korlátozást. Sunk.

Minden humán kromoszóma, csak egy folytonos DNS-szálat. Ez tele van nehezen illeszkednek a kromoszómán. Manipulált DNS-molekula, ez a hossz gyakorlatilag lehetetlen.

Ezért, a megnyitása a 70-es években a XX században. speciális bakteriális enzimek. vágni a DNS fragmensekre, ez nagyon hasznos. Enzimeket restrikciós enzimeknek hívják, vagy endonukleázzal.

A baktériumok, ezek az enzimek használják, hogy megvédje behatolása ellen idegen DNS sejtbe. Általában a restrikciós enzim felismerő az úgynevezett palindrom szekvencia megfigyelt nukleotidok a két DNS-szál és a következőkből állnak 4-6 nukleotid.

géntechnológia

Módszerek DNS-t klónozunk

Miután a DNS-t térhálósított in vitro, meg kell lemásolni.

Vannak két megközelítés a DNS klónozását. Az első megközelítés magában foglalja a bakteriális vagy élesztősejtek többszörösen vezetünk idegen DNS-t. A második módszer egy DNS in vitro amplifikálás.

DNS klónozása in vivo

Mikroorganizmusok segítségével lehet létrehozni kétféle DNS könyvtárak: genomi klonális.

A genomi könyvtárból. Ha a szervezet genomjába vágni, illessze be egy plazmid vagy virális vektor, és bejuttatjuk egy sejtbe, tárolható ebben a formában. Amikor vágás a plazmid vagy fág DNS valószínűségét egészében és változatlan darab a genom elég magas.

Ez a módszer a termelő genomi könyvtár úgynevezett „shotgun szekvenálás”, hiszen ebben az esetben a gén tartalmazza az egyes töredékek.

Alapelvei létrehozása plazmid és virális vektorok átfogó, ezért tartjuk őket a példa a plazmid. Meg kell jegyezni, hogy mivel a vírus-DNS jobb használni DNS fágok, mert van egy nagyobb kapacitású és lehetővé teszi, hogy helyezze be a nagyobb darabokat a genomban.

Tisztított cirkuláris DNS-molekula, kezeljük egy restrikciós enzimmel, így lineáris DNS-t. A celluláris DNS-t kezelünk az ugyanazzal a restrikciós enzimmel, plazmidot adunk, ligázt adunk hozzá. Az így kapott rekombináns plazmid DNS-t, amelyet be lehet vezetni baktérium- vagy élesztősejtek. A plazmid szaporodik, így sok példányban. Számos plazmid hordoz egy gént antibiotikum-rezisztencia, és ha a rekombináns plazmidot egy olyan gén a sejteket könnyen azonosítható nő a közegben egy antibiotikum.

Mindegyik kolónia utóda vagy klónja egyetlen sejt. Tartalmazó plazmidokat egyetlen telepet klón genom DNS és plazmidok aggregált lehet nevezni genomi DNS-könyvtárat. A hátránya ennek a módszernek, hogy a DNS fragmentumokat állítunk elő nagy mennyiségben. Vágás esetén genomiális DNS-t határozzuk meg, így csak egy része a fragmensek teljes géneket. Egyes fragmenseket csupán egy részét tartalmazhatja egy gén vagy intronszekvenciákat.

cDNS-könyvtár. Készítése cDNS-szintézis kezdődik RNS-templát alapján reverz transzkriptáz komplementer DNS-szál. Ezután létre az alapvető feltételeket elpusztítani RNS-szál nukleotidjainak, majd a DNS-polimeráz szintetizál egy komplementer DNS-szálat. Ez képezi egy olyan DNS-fragmentumot tompa végű. Az ilyen DNS-t plazmidba inszertáltuk, és bevezetjük egy bakteriális sejt. Ha a plazmidot amplifikációs generált komplementer másolata a DNS-klón.

Előnyök DNS klónozására genomiális DNS klónozására, hogy egy olyan fehérjét kódol, a nukleotid szekvencia a gén nem megszakadt.

A gének eukarióták tartalmaznak intronokat, amelyek el kell távolítani a transkriptnoy RNS konvertálása előtt egy mátrixba, majd splicing. A bakteriális sejtek nem tudja elvégezni ilyen módosítást a képződő RNS transzkripcióját az eukarióta sejtek gén. Ezért, ha folytat fehérje készítmény expressziójával egy klónozott gén, akkor jobb, hogy egy cDNS-könyvtár alapján készített hírvivő RNS.

Restriktsiya- ligációs

A klasszikus módszerek restrikciós és ligálási, klónozunk DNS-fragmenst négy lépést foglal magában: vágás a DNS restrikciós endonukleázokkal. A DNS-ligálást a vektorral. transzfekció és az azt követő szűrés.

Izolálása betétek

Kezdetben, akkor ki kell választania egy DNS-régiót klónozására. Gyakran DNS preparátumot készítettünk klónozásához a polimeráz-láncreakció. valamint a vágás a DNS-t restrikciós enzimekkel. DNS ultrahangos kezelés. frakcionálásával DNS agaróz elektroforézissel. Izolálása betétekkel lehet shotgun klónozási technológia, komplementer DNS-t. mesterséges kémiai szintézis.

transzformáció

Ligálás után a plazmid transzformált baktériumok felépíteni. A baktériumok továbbra is növekszik egy szelektív táptalajra kiválasztási telepeket tartalmazó inszerciókat. Egyedi telepeket választottunk, tanult jelenlétére betoldások.

transzfekció

Ligálás után a reakcióelegyet egy beépített a kívánt orientációban vektort a cellába helyezzük. Attól függően, hogy a használt sejt típusával kémiai érzékenyítés sejtek, az elektroporáció vagy a génpuska. A kémiai érzékenységet nem igényel speciális felszerelést. Az elektroporáció használunk szükség esetén a nagy hatásfokú transzfekciót. A gén-pisztoly használatos abban az esetben, a növényi sejtek és szövetek, mivel a növényi sejtfal megakadályozza idegen DNS, hogy behatoljanak citoplazmában és a sejtmagban.

Készül kultúra transzfektált sejtekben. Mivel a fent leírt eljárásokat gyakran alacsony hatékonyság, egy eljárás sejtek kimutatására, amely tartalmazza a kívánt inszertet a megfelelő orientációban és szétválasztását az ilyen sejteket a nem-paszta. Modern klónozó vektorok közé szelekciós markereket, amelyek lehetővé teszik, hogy a sejtek nőnek csak a helyes beiktatást növekedni a szelektív médiában. A klónozó vektorok tartalmaznak markerek gyakran okozva színezete a telepek, például amikor tápközegben növesztve, amely X-gal-t. A pontos visszaigazolást a sikeres klónozás ellenőrizni kell a segítségével a polimeráz láncreakció. RFLP vagy DNS-szekvenáló.

génterápia

DNS klónozó

DNS Cloning - egy előre meghatározott extrakciós eljárás a DNS-szekvencia és a termelés számos példányban ez in vitro. DNS klónozása gyakran használják, hogy amplifikáljuk a géneket tartalmazó. valamint bármely más posledovatelnosti- például promoterek. nem kódoló szekvencia. kémiailag szintetizált oligonukleotidok és véletlenszerű DNS-régiók.

Forrás: humbio.ru, dommedika.com, www.biotechnolog.ru, dic.academic.ru, ru.rfwiki.org