Tárgy №12
A cél az osztályban: tanulmányozni a szerológiai vizsgálatok (agglutináció), teljesítő technika és számviteli eredménye
Anyagok és berendezések. szérum, állvány csövek, tű, lemez RA.
A lényeg az, hogy a szérum hozzáadásával tartalmazó antigén-specifikus antitestek a egyenletes sejtszuszpenziót előfordul ragasztás, csomók képződését, csomók, amely fokozatosan felhalmozódik az alján a cső, amely egy jellegzetes csapadékot - agglutinálja folyadékot felette van fehérített. Ha az antigén egy bakteriális szuszpenzió rögzített (anélkül flagellumok), amelynek csak a szomatikus O-antigén finom csapadék keletkezik során 16-22ch. Ha az antigén egy szuszpenzió rendelkező baktériumok csillók (mobil fajok), és részt vesz agglutinációs együtt szomatikus még flagelláris H antigén krupnohlopchaty kialakítva, durva agglutinációk.
Az állatorvosi gyakorlatban, RA diagnosztikai célból alkalmazzuk brucellózis, szalmonellózis, colibacillózis, listeriosis, vibriosis, leptospirosis, és más betegségek. Számos módszer RA termelés: teszt-cső (térfogat), csepp (lemez), a vér-csöpög, hemagglutináció (WGA), hemagglutináció-gátlási (HAI), Coombs antiglobulin, RA Kastelani (agglutinin adszorpciós módszer), egy gyűrű alakú mintát tej.
Antigének többértékű - több meghatározó receptor egy antitest, és képes reagálni őket az állati szervezetben (in vivo), és a testen kívüli - in vitro (in vitro).
Antitestek - makromolekuláris fehérjék globulin frakció szérum (immunglobulinok). A megnyilvánulása a jelenség közötti kölcsönhatás az antigén és antitestek in vitro különböztetünk: üledékes (közvetlen) válasz, lizáló és semlegesítő. A szerepet játszó antitestek üledékes reakciókat nevezzük való kölcsönhatásának a antigénnel: aglyutininy-ok ragasztására korpuszkuláris antigén - aglyutinogena és a csapadék az antigén - antitest (agglutinálódnak); pretsipitiny-formában csapadékot Az oldható antigénnel - pretsipitinogenom.
Az üledékes szerológiai reakció fordul elő két szakaszból áll: az első fázisban - adott, láthatatlan szabad szemmel, amikor bekövetkezik a kialakulását az antigén - antitest, a második fázisban - nem-specifikus (fiziko-kémiai) - végső hatás nyilvánul - látható eredménye, csapadék az agglutinátum.
Az állatgyógyászatban és orvosi gyakorlatban szerológiai vizsgálatok, mint egy fertőző betegség diagnosztikai technikákat alkalmaznak: 1) meghatározzuk, azonosító (minőségi és mennyiségi) az ellenanyagok az állati szérumból egy szándékos és az ismert antigént; 2) meghatározzuk a specifikus antigén alkalmazásával az ismert ismert specifikus hiperimmun szérumok (anthrax, Salmonella, brucellózis és mtsai.), Kialakítása a faj (variáns) tartozó kórokozó izolálható a vizsgálati anyag (szerológiai azonosítása).
A szerológiai vizsgálatok is becsléséhez használt természetes és mesterségesen szerzett immunitás állati szervezetben. Szerológiai fel fiziológiás sóoldattal, mert a második fázisban zajlik slaboelektrolitnoy közegben.
Annak meghatározására, a szérum antitest (egy ismert antigént) először vért vettünk (5- 10 ml) a nyaki vénából az állat (a farok sertésekben) steril kémcsövekben, és tegye egy meleg helyen. Miután a vérrögképződés óvatosan elválasztjuk a falak a csövek, steril körülvegye a fémhuzal (elérhető kötés tű), és tegye hideg helyen a visszahúzás. A szérumot felszívni steril csövekbe, az utolsó számozva vannak, és küldött futár és egy kísérőlevelet a laboratóriumban. Az RA (valamint a szerológiai tanulmányok), vagy a friss szérum nélkül hemolízis vagy tartósított fenol, mertiolát, bórsav.
Antigen for RA egy fiziológiás só szuszpenzió elölt vagy élő baktérium. Diagnosztikai célokra kell használni a szabvány antigénnel. Ha arra van szükség, hogy azonosítsa a baktériumtenyészetet izolált kórbonctani anyag, használja standard szérum és az antigént előállíthatjuk egy éjszakán át tenyésztett - szintben IPA.
Berendezés beállítása RA .1) az állam csövek put 5 egy sorban. A sorok száma attól függ, hogy számos szérummintája kapott tesztelésre. A csöveket regisztrál (számozott) az üveg ceruzával. 2) Készítsünk elsődleges hígító valamennyi vizsgálandó szérum, valamint a kontroll - pozitív szérumok és a normál állatok (például szarvasmarha). Ebből a célból, az első cső készül számos 2,4 ml sóoldatban, és 0,1 ml szérum (1:25). 3) Készítsünk munkahígítását egyes szérumminták: a 3., 4., 5. csövek az összes sort készült 0,5 ml sóoldatot. Ezután, az első cső mérési pipettával (a „körte”) át a második és a harmadik kémcsőbe 0,5 ml szérum azon hígításának. A harmadik cső hozzáadása szérum keverve sóoldattal elhelyezték benne (nyert hígítás 1:50). A harmadik csőbe 0,5 ml szérumot vittünk át a negyedik, vegyes (hígítás válik 1: 100) és 0,5 ml átvisszük egy ötödik cső (hígítás 1: 200). 0,5 ml hígított szérumot öntjük korsó egy fertőtlenítő oldatot az utolsó csőbe. Így, a második, harmadik, negyedik és ötödik csövek fennmaradó 0,5 ml vérszérum 1:25 arányban hígított, rendre, 1:50, 1: 100 és 1: 200, vagyis kaptunk soros két-szeres hígításban egyes szérumminták. 4) A csöveket tartalmazó hígított szérumokat bevezetni antigént, előzőleg sóoldattal hígítjuk a kívánt koncentrációjú NaCl (brucellózis egyetlen antigén hígítjuk 1: 10-1000000000 mikrobiális szervek 1 ml), így kalibrált pipettával 0,5 ml mindegyik csőbe. Ennek eredményeként, a végső szérum hígítás 2-szer nagyobb (2-szeres koncentráció kevesebb) - 50,1 4. ill. 100, 1. 200, 1. 400, és az egyes kémcsövekben összesen komponenseket 1 ml. Az első ampulla antigén ne hozzá, ez szolgál a vizsgálandó szérum minőség-ellenőrzés. A komponenseket a RA bevezetett fiolákban elválasztásához (egyéni) volumetrikus pipettával (használatával gumi körte) vagy csoport adagolók. Hozzáadása után a vizsgálati és kontroll szérumot a antigénnel állványok csöveket óvatosan ráztuk és inkubátorba helyezzük 16-20 órára (37-38 ° C), majd inkubáljuk 1-2 órán át szobahőmérsékleten, amely után figyelembe veszi a agglutinációs reakció.
RA számviteli elvégezni, hogy a szabad szemmel (vizuálisan) keresztül vagy seroscopy Minden csőbe, kezdve a kontrollok. Ha vannak pelyhek fibrin, vörösvérsejtek és a szennyeződéseket az első kémcsőben tapasztalt számos RA nem veszi figyelembe. RA eredmények meghatározni keresztezésekben az alábbiak szerint:
++++(#) - a teljes megvilágosodás folyadék feletti teljesen állandó alján a cső formájában agglyutina ismertetett fordított fehér csipkés napernyő. Amikor rázás az esernyő ismét, bomlik pelyhek és csomók, és a folyékony tiszta marad. Úgy tartják, hogy ott már 100% agglutináció
+++ (+++) - hiányos folyékony oktatás, de jól meghatározott esernyő (75% agglutinációs -s). Ha rázza a agglutinátum darabokra törtük, rögök, csomók; Folyékony enyhén zavaros;
++ (Két kereszt) - jelölt fehérítő folyadék mérsékelten expresszálódó esernyő (50% agglutináció), rázással az üledéket osztva kisebb csomók és rögök, zavaros folyadék;
(+) - alig észrevehető fehérítő folyékony esernyő gyengén expresszálódik, rázással az üledéket darabokra törtük, és kis mennyiségű csomók (25% agglutinációs) egyértelműen zavaros folyadék;
- (mínusz) - Fehérítő folyadék és kialakulását az esernyő hiányzik, az alján a csöveket a központban látható „vagy FAD” egy gomb „- egy kompakt sejtüledéket (mikrobák) antigén van törve rázással egységes zavaros szuszpenziót kapunk.
Indikátorok agglutinációt csövek két, három vagy négy kereszt jellemzi pozitív reakciót. Utolsó szérum hígítást, ahol agglutinációval becslések két, három és négy kereszt, szerint a titer. Diagnosztikai értékelését a agglutinációs reakciót figyelembe véve a súlyosságát egy kereszt és annak magassága titere (a különböző betegségek).
A szerológiai diagnózis több lehetőség kimutatása RA - microagglutination reakciót. ha az eredmény figyelembe veszi a zúzott folyadék csepp a dia mikroszkóp alatt. Figyelembe egy cseppentő pipettával a kémcsőből, amelyben a szérumban és az antigén össze vannak kötve. A gyakorlati alkalmazása ennek a reakció megtalálható a diagnózis a leptospirosis, szérum készít BioIndustry. Kioldása azt száraz (liofilizált) formában.
Az állatgyógyászatban, Coombs reakciót fejlesztett diagnosztizálására a szarvasmarha-brucellózis formájában bakteriális variánsok.
Kialakításának módszerei Coombs reakció. A reakció komponenseket; brucellózis antigén (sóoldattal mossuk 2-3-szoros centrifugálás) vizsgálat alatt marhaszérum, antiglobulin szérumot. Pre-tegye a szokásos RA négy szérumhígításokat 1: 50: 400. úgy az eredményeket, majd meghatározza a végső cím. A csövet a szérum határértéket titer eltávolítjuk, és a tartalmát ezen csövek vizsgáltuk jelenlétére szülői antitestek: ezekben db kémcső 2 ml sóoldatot, a minden egyes cső tartalmát átvittük egy centrifugacsőbe, centrifugáltuk 4000 fordulat / perc, a felülúszót eltávolítjuk, az üledéket resuspen-diruyut. 2 ml sóoldatot ismét centrifugáltuk azonos körülmények között. Miután a második öntőcsatorna és a felülúszó eltávolításával, az üledéket 1 ml antiglobulin szérumot (titer a munka), az elegyet inkubátorba helyeztük 18 órán át (37 ° C), majd hagyjuk állni 2-4 órán át szobahőmérsékleten, majd úgy az eredményt a hagyományos RA. Minimális működési titer Coombs reakcióval szarvasmarha-brucellózis tekinthető) 1: 200, 1: 100 minősül kétes eredményt.