Géntechnológiai módszerekkel közvetlen gén bevezetése (transzfekció, mikroinjekció, elektroporáció,
Csomagolás a liposzómák
Történő transzfekciójával DNS adszorbeált kristályok kalcium-foszfát (Graham Van der Eb, 1973). Részecskék képződnek kalcium csapadékot. Szívódnak fel a sejt fagocitózis.
Ahhoz, hogy a hatékonyság növelése a konverzió specifikus DNS a gént tartalmazó, amellyel történik kiválasztás adunk specifikus hordozó DNS. Általában erre a célra, figyelembe DNS borjútimusz vagy lazac sperma. Része a DNS kötődik a membránhoz, és nem jut be a sejtekbe. DNS elfogadja 15-90% a sejtek. Néhány nappal a beadás után egy kis töredéke képes sejtek az idegen géneket expresszáló, az expressziós szint, de azután leesik, többé vagy kevésbé stabil transzformáció megy keresztül 10 -3 - 10 -5-sejtek.
A transzfekcióhoz DEAE-dextrán és a polimer adszorbeáló DNS. A hatás a belépő sejtek és kifejező ideje magas, de a stabil transzformáció gyakorisága kisebb, mint a kalcium-csapadékot. A frekvencia a transzfekció növeli a glicerin-sokk (4 percig 15% glicerint tartalmazó oldattal a NEPES pufferben).
A sejteket beadhatjuk bármely gén, ha előre ligáiható legyen a klónozott szelektálható markert. Azonban, további vizsgálatok kimutatták, hogy ligálása sejtek nem szükséges. A sejteket elnyelő szelektív gén együtt, és elnyeli egy másik DNS-t kalcium-csapadékot. Így módszerrel együtt-transzformálási. Gyakorlatilag bármilyen klónozott DNS-szegmens lehet illeszteni tenyésztett eukarióta sejtek, ha engedélyezi ezt a DNS-t együtt a szelektálható marker a keverékben a kalcium keletkezik csapadék.
Transzfekció lehet használni fragmenseit kromoszómák vagy kromoszóma. Donor sejteket blokkoltuk a mitózis fázisban. A mitotikus kromoszómák szabadulnak hatása alatt ozmotikus sokk és homogenizáció. Ezeket tisztítjuk differenciális centrifugálással. A kromoszómák letétbe felszínén sejteket kalcium-kloriddal, és néhány órával később kezeljük képes reagenssel perforált membrán (például glicerin).
Kezelésére a recipiens sejteket alkalmazunk, durván tisztított készítmények a kromoszómák, így kromoszómák így elpusztult legalább. Kromoszómák száma feldolgozására egy cellában korlátozott. Sokkal jobb, hogy használni nem több, mint 20 kromoszómák 1 retsepient cellában, mivel magas koncentrációban kromoszómák szuszpenzióban általuk agglutinálja. Retsepientnaya donor cella tartalmaz töredékei kromoszómák, amely integrálható a genomba is függetlenül replikálódjon. A fenti részeket gyakran megfigyelt törléseket.
Nem minden sejtek transzformálására képes a genomiális DNS-t egy nagyfrekvenciás. Humán fibroblasztok, hogy hatékonyan tartalmazza a plazmid DNS-t és szinte nem tartalmaznak genomiális.
DNS mikroinjektálása emlőssejtekbe lehetővé vált az Advent az eszköz gyártásához mikropipetták átmérője 0,1-0,5 mikron, és egy mikromanipulátorral (ábra. 45). Így egy plazmidot tartalmazó fragmenst a herpesz vírus timidin kináz gén (TK) és a pBR322 plazmid, injektáltunk a TC - sejtekben és kimutattuk, hogy a TC - gén behatolt a mag, és általában replikálódnak ott. DNS bevezetése módszerrel mikro-injekciós alakult ki a korai 70-es években az Anderson és Diakumakosom. Alapvetően, ha a jó felszerelés lehet beadni 1 óra 500-1000 sejtek, és az a legjobb kísérletek 50% -ában a sejtek figyelhető stabil integrációját és expresszióját az injektált gén. Az előnye, hogy a leírt eljárás kulcsa az is tény, hogy lehetővé teszi, hogy be semmilyen DNS bármilyen sejtté, és fenntartani a bevitt gén a sejtek nem igényel szelekciós nyomás.
Ábra. 45. A DNS bevitele mikroinjekció
Elektroporációt azon a tényen alapul, hogy a nagyfeszültségű impulzusok reverzibilisen permeabilitásának növelésére a biológiai membránok. Szerdán, elektroporáció sejteket adunk, és a DNS-fragmenseket kell juttathatók be a sejtekbe (ábra. 46). Közvetítésével halad nagyfeszültségű impulzusok (feszültség 200-350 V, 54 ms impulzushossz), ami a pórusok képződését (elektroproboy) a citoplazma membránban, az élettartam, és amely elegendő méretű ilyen makromolekulák, mint például DNS-t, tud belépni a sejtbe a külső környezetből eredményeként ozmotikus erők. A kötet a sejt növekszik.
Az elektromos térerősség és hatástartam, a koncentráció a transzformáló DNS-t és a recipiens sejteket az egyes kísérleti cella rendszert úgy választjuk meg, hogy magas százalékban DNS-felvétel által a túlélő sejtek. Kimutatták, hogy optimális körülmények között a transzformánsok elektroporáció száma elérheti a 80% -át a túlélő sejteket.
Az elektroporáció - inkább fizikai, mint biokémiai módszer, és ez valószínűleg a széles körben használják. Számos vizsgálat igazolta, hogy az elektroporáció is sikeresen alkalmazhatók DNS bevezetésére molekulák különböző típusú sejtek, mint például a tenyésztett állati sejtek, protozoák, élesztő, baktériumok, és a növényi protoplasztok. Az elektroporált nagyfeszültségű kisüléseket hatása kétrétegű lipid membrán úgy tűnik, függ a görbületi sugár. Ezért a kis bakteriális sejtek hatékonyan felvenni a DNS egy lényegesen nagyobb feszültséget (10 kV / cm vagy több), mint a nagy állati és növényi sejtek, hatékonyan elnyeli DNS térerősségnél 1-2 kV / cm.
Az elektroporációt - a legtöbb egyszerű, hatékony, és reprodukálható módszer a DNS bevezetésére sejtekbe. Egészen a közelmúltig azonban ezt a módszert használták a korlátozott számú laboratórium hiányában soros eszközök - elektroporátorban. A megjelenése és fejlesztése az ilyen eszközök az elkövetkező években fog vezetni a széles körben elterjedt ez a megközelítés a géntechnológia sokféle sejttípus.
Ábra. 46. A módszer elektroporáció
„Mini-sejtek” blokkolásával készített mitózis colcemid donor sejtek. Folyamatos feldolgozásra colcemid a sejtekben, amelyekben az egyes kromoszóma körül van kialakítva egy új nukleáris membránon. Feldolgozás cytochalasin B és centrifugálás eredmények a kis sejtek képződésének, ami mikrokernel kapszulázott a citoplazma membránban.
A kapott mini-sejtek nagyon érzékenyek a mindenféle hatások, így összefésülés kiválasztani puha feltételekkel. Módszer nehéz, Moody, alacsony hatékonyság - 10 -6 - 10 -7.
Csomagolás liposzómákba védelmére használt exogén genetikai anyagot a pusztító hatás a restrikciós enzimek.
A liposzómák - gömb alakú héj képez foszfolipidek. Készítette az éles rázva keveréssel vizes oldatot és a lipid vagy vizes emulzió szonikációs foszfolipidek. A liposzómák álló foszfatidil-szerin és a koleszterin a leginkább alkalmasak, amelyekkel DNS állati és növényi sejtek. Átutalási rendszer keresztül liposzómák alacsony toxikusak a sejtekre.
Módszer biológiai ballisztikai (biolisztikus) az egyik leghatékonyabb eddigi transzformációs eljárások a növények, különösen az egyszikűek.
A módszer abban áll, hogy a legkisebb részecskék volfrám, átmérője 0,6-1,2 mikron, permetezett DNS-vektor a kívánt gént tartalmazó konstrukciót a transzformációhoz. Tungsten részecskéket hordozó DNS, alkalmazzák a celofán hordozóréteget és belsejében elhelyezett biolisztikus fegyvert. A kalluszt vagy szuszpenziós sejtek kerül egy Petri-csészébe agar tápközeggel, és alá helyezzük biolisztikus fegyvert a parttól 10-15 cm. Gun vákuumszivattyú csökkenti a nyomást 0,1 atm. A nyomáscsökkentéssel ideje volfrámrészecskék kiadja nagy sebességgel egy biolisztikus fegyvert és törés a sejtfalakat szerepelnek a citoplazmában és a sejtmagban a sejtek.
Jellemzően, a sejteket, amelyek közvetlenül az A sajtolószerszám közepén miatt a puszta mennyisége és nyomása a volfrám részecskék, míg a területen 0,6-1 cm-re a központ legkényelmesebben protransformirovannye sejtek. A sejteket azután óvatosan átvisszük egy közepes további tenyésztésre és a regeneráció.
A biolisztikus fegyver protransformirovany egyszikűek, mint például a kukorica, rizs, búza, árpa. Így kaptuk stabil transzformánsokat a növény. További előrelépés megszerzése transzgenikus egyszikűek, biolisztikus transzformáció használatos a közvetlen transzfer DNS embriogén pollen és további gyors dihaploid megszerzésére transzgenikus növények, amelyek fontos lépés a tenyésztésben. Jelenleg ezt a módszert végeztünk, és az átalakulás a dohány növények regenerálása után haploid növények kapott stabil transzformánsokat.
További fejezetek ez a rész: