Géntechnológiai módszerekkel géntechnológia - rekombináns DNS-konstrukcióban

A géntechnológia a növények

Rekombináns DNS-

Alatt érteni rekombináns DNS kombinálásával kialakított in vitro (in vitro) A két vagy több elkülönített DNS-fragmentumokat a különböző biológiai forrásokból. A kulcs ebben a definíció a „DNS-fragmens” és „Association in vitro”, ami azt jelzi, a természet a géntechnológia, és ez eltér az összes többi előállítási módszereinek hibrid (vagy kiméra) organizmusok, mint például a genetikai kiválasztás, embrionális mérnöki, stb

DNS-fragmentumok, beleértve fragmentumokat tartalmazó géneket állítunk elő a restrikciós enzimekkel enzimek. A restrikciós enzimek képezhetnek mind fragmentumok tompa vagy ragadós végek. Térhálósítása DNS által termelt fragmensek három fő módszer, attól függően, melyik a végek térhálósítható DNS-fragmensek.

A térhálósítás az azonos nevű „ragadós” végeket (restrikciós enzim ligáz módszer)

Ez a módszer a leggyakoribb és legnépszerűbb. Ez az első alkalom ezen a módon a hibrid DNS-t kapunk S. Cohen és munkatársai 1973-ban. Néhány restrikciós enzim, mint például PstI, DNS bevezetését szimmetrikus elhelyezve ferdén lánc széttörhető egyenlő távolságra a központtól a felismerési hely és a forma egy „lépés” (lásd. 36.). Ezek a komplementer részek egymáshoz általában összefüggésbe miatt bázispárosodás, és ezért nevezzük őket, vagy komplementer ragadós végekkel. Bázispárosodás történik csak közötti komplementer szekvenciák, úgy AATT végeket kialakítva EcoRI, nem párosodnak, például AGTST-végek által alkotott Hind III. De bármely két fragmens (függetlenül azok származási) alatt képzett azonos restrikciós enzimmel, lehet összeragadnak képződése miatt a hidrogénkötések nukleotidok között a komplementer egyszálú szakaszok (ábra. 39).

Ábra. 39. Az áramkör restrikciós enzim - ligáz módszerrel

Azonban, miután ilyen teljes illeszkedő integritását a kettős spirál helyreáll, hiszen a két megtöri foszfodiészterváz. Annak hasznosítására, azaz a tűzés, ligálással vagy fonalak DNS-ligáz enzimmel. Ez az enzim egy élő sejt ugyanaz a funkciója - térhálósító DNS fragmentumok szintetizált replikáció során.

Térhálósítás „tompa” végek (a csatlakozó módszer)

A ragadós végeket nem feltétlenül szükséges a kötési DNS-fragmentumok. Tompa végeket is csatlakozott hatására DNS-ligázt, ha ligáz, és tompa végeket vannak jelen a reakcióelegyben nagy koncentrációban. Ebben az esetben a ligálási megvannak a saját jellemzői és hatékonysága alacsonyabb, mint a keresztkötések által ragadós végeket. Az első ilyen kísérleteket 1972-ben Paul Berg, Stanford University, USA. A ragadós végek úgy is enzimatikusan kapcsolódik a DNS-molekulák tompa végű. Erre a célra, az enzim - terminális transzferáz borjú-csecsemőmirigyből, hogy tulajdonít nukleotidok az 3 „végén a DNS-láncok. Ha egy 3'-végén az egyik kombináljuk in vitro, DNS fragmentumok terminális dezoxinukleotidil kivitelben egyszálú oligo (dA) -segmenty bizonyos hosszúságú, és a végén a többi fragmentum - oligo (dT) -segmenty megközelítően azonos hosszúságú, majd keverjük össze, így kapunk széttöredezi módon párosodás révén a hidrogén kötések kialakulását az oligo (dA) - és oligo (dT) -sequences (40. ábra). A kovalens kötéssel a két fragmens DNS-ligáz segítségével. Ezek az eljárások képezik az alapját a második általános módszert előállítására rekombináns DNS-molekulák.

Ábra. 40. Sew „ragadós” végeket, és kereszt-DNS-fragmentumok összekapcsolása

Amint képezhetők kellően hosszú vzaimokomplementarnye egyszálú végek, a hibrid molekulák keletkeznek nagy hatékonysággal. Különösen, így amikor DNS-t klónozunk példányban mRNS, amelyek rendelkezésre állnak a korlátozott mennyiségben, általában egy csatlakozó is¬polzuyut módszerrel. Ezzel a módszerrel a kapcsolatot fragmentumok között beágyazott részei AAAA. Ilyen további TTTTT szekvencia működését befolyásolják csatlakoztatott molekulák, és ezért, amikor csak lehetséges, és így kapjuk a rekombináns DNS-molekulák ragadós végeket kialakítva, mint eredményeként a restrikciós enzimek.

A térhálósító fragmensek ragadós végekkel szemben

Olyan helyzetekben, amikor azt szeretnénk, hogy öltés a töredékek amelyet különböző restrikciós enzimekkel, és különböző, azaz nem egymással komplementer ragadós végek használt úgynevezett kapcsolókat (vagy „adapter”). Linkerek - kémiailag szintetizált oligonukleotidokat képviselő restrikciós helyek, vagy ezek kombinációja. Ez az első alkalom ez az ötlet által javasolt Scheller és munkatársai 1977-ben.

Vannak nagy gyűjtemények ilyen gén „adapterek”. Természetesen akkor, ha a kapcsolókat kell figyelembe venni annak szükségességét, hogy tartsák tiszteletben a szabályokat a genetikai információ kifejeződése. Gyakran a közepén a kapcsoló, hogy egy genetikai szabályozó elem, például egy promoter vagy kapcsolódó webhely helytől. Ebben az esetben a kapcsolókat nem csak a szakszervezeti gének, de okozhat annak expresszióját. Van kapcsolókat „tompa végű - ragadós vég.”

Ha szükséges, a ragadós végeket lehet alakítani tompa. Ezt úgy érjük el, hasítása a ragadós végeket egy enzimmel - az S1 endonukleáz, amely tönkreteszi az egyetlen egyszálú DNS-vagy ragadós végek „épül”, azaz a DNS-polimeráz I szintetizálására egyszálú kohézív végei a második szál.

További fejezetek ez a rész: